Алтернативи на метиленско сино за микроскопија

За едноставен бактериски размасок, кристал виолетово може да го замени метиленското сино кога целта е да се види обликот на клетките. За живи клетки, подобра алтернатива може да биде фазен контраст без никакво боење. Изборот зависи од набљудувањето што треба да го направите.

Да претпоставиме дека две лица ја испитуваат истата бактериска култура. Едното сака да разликува стапчести од тркалезни клетки. Другото сака да утврди дали некој третман ги убил бактериите. Боење што му дава јасна слика на првото лице може на второто да не му даде употреблив одговор.

Пред да изберете замена, довршете ја оваа реченица: „Треба да набљудувам ___ во ___, а клетките мора / не мора да останат живи.“ Таа реченица ја дефинира задачата што боењето мора да ја изврши.

Започнете со примерокот и прашањето

Прво одлучете дали клетките мора да останат живи, а потоа утврдете која карактеристика треба да ја набљудувате:

Клетките мора да останат живи: за движење или облик, разгледајте фазен контраст без боење или DIC; за јадрена DNA, разгледајте Hoechst 33342 со флуоресценција; за интегритет на мембраната, изберете валидиран тест како SYTO 9 со пропидиум јодид.
Клетките не мора да останат живи: за бактериска морфологија, разгледајте едноставно боење со кристал виолетово или негативно боење со нигрозин; за Грам-реакција, користете го целосниот метод на Грам-боење; за јадрена DNA во фиксирани клетки, разгледајте DAPI флуоресценција. Користете ја оваа табела за да ги споредите ограничувањата на секоја гранка. Ова се избори на метод, а не упатства за замена на шишиња во постоечки протокол.

Што треба да набљудувате	Примерок и опрема	Можна алтернатива	Главно ограничување
Бактериски облик и распоред	Подготвен бактериски размасок; светлополна микроскопија	Едноставно боење со кристал виолетово	Ја прикажува морфологијата; не ја утврдува Грам-реакцијата ниту виталноста.
Контури на клетки на темна заднина	Бактериолошки препарат; светлополна микроскопија	Негативно боење со нигрозин	Подготовката и формулацијата се важни; необоена клетка не е нужно жива.
Грам-реакција	Подготвен бактериски размасок; светлополна микроскопија	Целосен метод на Грам-боење	Потребни се целосната низа реагенси и контроли.
Движење или промени кај живи клетки	Компатибилен влажен препарат; фазен контраст или DIC	Без боење	Потребна е соодветна оптика; контрастот не идентификува молекула.
Јадрена DNA	Фиксирани клетки; флуоресценција	DAPI	Потребни се компатибилни филтри за ексцитација и емисија.
Јадрена DNA во живи клетки	Живи клетки; флуоресценција	Hoechst 33342	Навлегувањето во клетката не докажува дека условите за снимање се безопасни.
Интегритет на бактериска мембрана	Нефиксирани бактерии; флуоресценција	SYTO 9 со пропидиум јодид	Боењето на мембраната е индиректна мерка за виталност.

За едноставен размасок, внимателно заменете го методот

Кристал виолетово е практичен кандидат кога задачата е еднобоен приказ на бактериската морфологија. Bacteriological Analytical Manual на FDA наведува две формулации со кристал виолетово погодни за едноставно боење. Користете документирана формулација и нејзиниот метод на подготовка; само името на бојата не определува работен реагенс.

Кристал виолетово се користи и во Грам-боењето, но тоа не значи дека едноставното боење со кристал виолетово е Грам-боење. Во протоколот за Грам-боење на ASM, диференцијалниот резултат зависи од последователното дејство на кристал виолетово, јод, обезбојување и контрабоење. Изоставувањето на тие чекори го менува она што може да се утврди од сликата. Видете едноставно боење наспроти Грам-боење за таа разлика.

Нигрозин нуди поинаков начин за прикажување на контурите: ја затемнува заднината, додека бактериските клетки остануваат релативно светли. Во упатствата на Merck за нигрозин има важен детаљ што може да се пропушти во општ список на замени. Наведената работна формулација содржи формалдехид. Затоа не можете да заклучите дека е компатибилна со живи клетки само од изразот „негативно боење“, иако самите клетки изгледаат необоени. Проверете ја целосната формулација и подготовката на примерокот.

За живи примероци, разгледајте промена на оптиката

Ако сакате да набљудувате како клетките се движат или делат, воведувањето друга боја може да го усложни набљудувањето. Како што објаснува Nikon во својот водич за контраст кај проѕирни примероци, фазниот контраст и диференцијалниот интерференциски контраст, или DIC, ги прават примероците видливи преку разлики во нивните оптички својства. Тие можат да прикажат живи, необоени клетки, под услов микроскопот да ги има потребните компоненти.

Овој избор овозможува препаратот да остане необоен, но ги менува достапните информации. Можете да следите граница или движење без да знаете која молекула го создала контрастот. Ако прашањето е молекуларната локализација, наместо тоа изберете соодветен метод на означување.

За јадрена DNA, споредбата на DAPI и Hoechst бои од Invitrogen ја разликува вообичаената употреба на DAPI со фиксирани клетки од Hoechst 33342, кој полесно навлегува во клетките и се претпочита за означување на живи клетки. За двете е потребна опрема за флуоресценција. Ниту една не е директна замена за обоено светлополно боење.

Третирајте ја изложеноста на боја и осветлувањето како експериментални услови. Споредете обоени и необоени препарати кога однесувањето на клетките е параметарот што го мерите.

Црвена клетка не е автоматски мртва клетка

SYTO 9 и пропидиум јодид често се користат заедно за процена на интегритетот на бактериската мембрана. Прирачникот BacLight ги поврзува непроменетите мембрани со зелено боење, а оштетените мембрани со црвено боење. Тоа толкување треба да се валидира за конкретниот примерок.

Студија од 2019 година на Rosenberg и соработниците го илустрира проблемот. Кај 24-часовни биофилмови на E. coli на стакло во фосфатно пуфериран солен раствор, околу 96% од клетките изгледале позитивни на пропидиум јодид in situ. Сепак, авторите процениле дека 82% можеле да се култивираат по собирањето. Конфокалните слики покажале клетки со зелена внатрешност под црвено обоен материјал, што укажува дека екстрацелуларните нуклеински киселини придонесувале за погрешниот сигнал.

Тие проценти опишуваат различни мерења на препаратите од студијата, а не универзален корективен фактор. Корисната поука е да проверите што го создало сигналот. Во биофилм, боја за нуклеински киселини може да детектира материјал надвор од клетките, како и во оштетените клетки. За заклучок за виталноста, истражувачите препорачуваат дополнителни мерења, како култивирање или метаболичка активност, при што признаваат дека секое од нив има ограничувања.

Проверете што навистина содржи алтернативата

Алтернативен метод на боење сепак може да содржи метиленско сино. Giemsa е пример: Merck го опишува својот производ како раствор од азур-еозин-метиленско сино, наменет за примени што вклучуваат размасоци од крв и коскена срцевина. Тоа може да биде различен метод за различен примерок, но не исполнува барање за исклучување на метиленско сино.

Ако исклучувањето на некое соединение е дел од експериментот, проверете го идентитетот и формулацијата на реагенсот пред да ги споредите сликите. Водичот за метил сино, метиленско сино и бои со слични имиња ги објаснува разликите во именувањето.

Потврдете ја замената пред да го користите резултатот

За нов метод, направете мала споредба со репрезентативни примероци и соодветна контрола. Каде што е можно, одржувајте ги поставките на микроскопот споредливи. Запишете ги формулацијата на реагенсот, подготовката на примерокот, изложеноста и условите за снимање, за да може подобриот изглед на сликата да се испита, а не само да се претпочита.

Оценете го успехот според првичното прашање. За морфологија, проценете дали границите и распоредот на клетките остануваат разбирливи. За јадрено означување, проценете ги местоположбата на сигналот и заднината. За виталност, барајте докази надвор од визуелно привлечното раздвојување на боите. Поширокиот водич за боење со метиленско сино и лабораториски примени објаснува како набљудувањето и подготовката се вклопуваат заедно.

Изберете ја алтернативата што го зачувува мерењето што ви е потребно. Бојата е само едно својство на добиената слика.