Kā metilēnzilais iekļūst šūnās: reducēšanās, atkārtota oksidēšanās un sadalījums starp membrānu fāzēm

Vērojot, kā endotēlija šūnas traukā uzņem metilēnzilo, acīmredzamais skaidrojums vienlaikus ir arī kļūdains. Vide zaudē zilo krāsu, šūnās parādās zilas granulas, tātad krāsvielai vajadzēja šķērsot membrānu zilās molekulas veidā. Eksperimenti rāda ko citu. Zilā forma membrānu šķērso tikpat kā nemaz. To šķērso bezkrāsainā forma, bet zilā forma, ko redzat šūnā, rodas turpat pēc iekļūšanas.

Šī pretējā notikumu secība ir svarīga, jo tā nosaka, ko krāsojums var un nevar atklāt. Zilās granulas liecina par oksidētu krāsvielu, kas ir atkārtoti oksidējusies un aizturēta organellās. Tās neatspoguļo kopējo krāsvielas daudzumu šūnā, neatspoguļo reducētās formas kopumu un nemēra bioloģisko iedarbību. Lai saprastu, kāpēc tā ir, izsekojiet trim posmiem: reducēšanās uz virsmas, reducētās formas difūzija, atkārtota oksidēšanās un aizturēšana šūnas iekšienē.

Abas formas uzvedas kā atšķirīgas molekulas

Oksidētais metilēnzilais ir plakana, pozitīvi lādēta gredzenu sistēma. Tas šķīst ūdenī, spēcīgi absorbē gaismu aptuveni 600 līdz 700 nanometru diapazonā un izskatās zils. Būtiskākais ir lādiņš. Lādēta, hidrofila molekula nevar viegli izkļūt cauri lipīdu membrānai, tāpēc literatūrā piesardzīgi norāda, ka tā ir salīdzinoši membrānu necaurlaidīga, nevis pilnīgi necaurlaidīga.

Reducētais metilēnzilais, ko sauc par leikometilēnzilo, ir bezkrāsains, bez lādiņa un šķīst taukos. Kad lādiņš pazūd, membrāna vairs nav šķērslis. Reducētā molekula viegli difundē tai cauri un, nonākusi vidē ar lielāku oksidēšanas spēju, var atkal zaudēt elektronus un atgriezties zilajā, lādētajā formā, kas paliek aizturēta. Tādējādi krāsvielas oksidēšanās un reducēšanās ķīmija ir arī tās transporta mehānisms. Mainot elektronu skaitu, mainās caurlaidība.

Pirmajam posmam nepieciešamos elektronus nodrošina pati šūna. Zīdītāju šūnas veic elektronu transportu pāri plazmatiskajai membrānai, pārnesot reducējošos ekvivalentus no donoriem šūnas iekšienē uz akceptoriem pie tās virsmas. Šī darbība pāri plazmatiskajai membrānai ir normāla šūnas funkcija, kas sastopama vairumā šūnu tipu. Endotēlija virsmas reduktāzei, kura apstrādā tiazīna krāsvielas, ir viena zīmīga kopīga īpašība ar citām šādām reduktāzēm: tā turpina darboties cianīda un azīda klātbūtnē devās, kas aptur vēlākos posmus. Šī procesu nošķiršana ir visa skaidrojuma atslēga.

Vispirms pētīja sadalījumu starp fāzēm, un tas gandrīz izskaidroja uzņemšanu

1929. gadā Mariana Ērvina Rokfellera institūtā uzdeva vienkāršāku jautājumu. Varbūt krāsvielas iekļūšanu nosaka tikai tās sadalījums starp ūdeni un šūnas taukainajiem slāņiem, un laboratorijā šos slāņus var aizstāt ar hloroforma slāni. Savos spektrofotometriskajos pētījumos par iekļūšanu šūnās viņa sakratīja krāsvielu ūdens šķīdumus ar hloroformu un salīdzināja to, kas pārgāja organiskajā fāzē, ar to, kas iekļuva dzīvās aļģu šūnās.

Divi šā darba atklājumi joprojām ir uzmanības vērti. Pirmkārt, komerciāli pieejamie metilēnzilā šķīdumi saturēja trimetiltionīnu, ko tagad sauc par azure B, un šis piemaisījums iekļuva šūnās ātrāk nekā pats metilēnzilais, īpaši sārmainā pH, kur dominē lipīdos šķīstošā brīvās bāzes forma. Daļa šķietamās metilēnzilā iekļūšanas patiesībā bija selektīva azure B iekļūšana. Otrkārt, pH noteica iznākumu, nosakot jonizācijas stāvokli, un bojātas šūnas uzņēma daudz vairāk krāsvielas nekā neskartas. Sadalījuma koeficienti un lādiņa stāvoklis noteica, ko absorbē mākslīgā sistēma un ko — dzīvā šūna, un abu līdzība atbalstīja domu, ka šūnas robežā ir slāņi, kas nav ūdens fāzes.

Modelis tālredzīgi izcēla lipīdu un jonizācijas nozīmi, taču tas nespēja atšķirt krāsvielu, kas sadalās starp fāzēm nemainītā veidā, no krāsvielas, kas uz virsmas tiek ķīmiski pārveidota, šķērso membrānu citā formā un šūnas iekšienē tiek pārveidota atpakaļ. Lai to nošķirtu, bija vajadzīgs cits eksperiments, kas tika veikts septiņdesmit gadus vēlāk plaušu endotēlijā.

Reducēšanās ārpusē, aizturēšana iekšienē

Merkers un kolēģi strādāja ar kultivētām liellopu plaušu artēriju endotēlija šūnām un piedāvāja trīs posmu secību: oksidētā krāsviela uz šūnas virsmas tiek reducēta līdz bezkrāsainajai lipofilajai formai, reducētā forma difundē šūnā, un atkārtota oksidēšanās šūnas iekšienē atjauno membrānu necaurlaidīgo oksidēto formu, kas uzkrājas. Savā pētījumā par tiazīna krāsvielu uzņemšanu endotēlijā viņi pārbaudīja šo secību, mēģinot to pārtraukt noteiktos posmos.

Pirmais līdzeklis bija fericianīds — elektronu akceptors, kas nevar iekļūt šūnā. Kad virsmas enzīmi ārpus šūnas reducē zilo krāsvielu līdz bezkrāsainajai formai, fericianīds var atņemt šos elektronus, atjaunojot zilo krāsvielu vidē, pirms tā šķērso membrānu. Kamēr fericianīds bija pārākumā (10 mikromolāra krāsviela pret 50 līdz 500 mikromolāru fericianīdu), krāsvielas uzņemšana gandrīz apstājās, un tikai pēc fericianīda izlietošanas tā atsākās parastajā ātrumā. Kinētika to pašu atklāja arī citā veidā. Fericianīda daudzums samazinājās aptuveni nemainīgā ātrumā, kas atbilda vienmērīgai reducēšanās plūsmai uz virsmas, kura nodrošina atkārtoti izmantojama mediatora darbību, savukārt ārpusšūnas krāsvielas daudzums samazinājās eksponenciāli, izsīkstot tās krājumam. Nemainīga plūsma kopā ar izsīkstošu krājumu nozīmē, ka fericianīda signāls atspoguļo nepārtrauktu reducēšanos, nevis krāsvielas molekulu iziešanu no šķīduma.

Otrais līdzeklis pilnībā izslēdza membrānas šķērsošanas posmu. Pētnieki piesaistīja toluidīnzilo O, tuvu tiazīnu saimes radinieku, lielai poliakrilamīda ķēdei, kas bija pārāk liela, lai iekļūtu šūnā jebkurā oksidēšanās stāvoklī. Šūnas joprojām reducēja piesaistīto krāsvielu. Tātad reducēšanai nav nepieciešama piekļuve šūnas iekšienei. To nodrošinošā sistēma ir pieejama uz virsmas vai elektriski saistīta ar to.

Tad tika nošķirti procesi, uz kuriem norāda publikācijas nosaukums. Cianīds un azīds 2 milimolārā koncentrācijā spēcīgi nomāca krāsvielas uzkrāšanos, un mikroskopā tumši zilie un violetie ieslēgumi, kas parasti apņem kodolu, gandrīz izzuda. Tomēr neviens no inhibitoriem nepalēnināja ārpusšūnas reducēšanos: fericianīda cikliskā aprite turpinājās nemainīgā apjomā, un membrānu nešķērsojošais polimērs joprojām tika reducēts. Bloķēts bija vēlāks posms. Cianīds un azīds apturēja atkārtoto oksidēšanos un aizturēšanu šūnas iekšienē, nevis reducēšanos uz virsmas. Dzīvotspējas pārbaudes apstiprināja šo skaidrojumu, jo šīs apstrādes laikā šūnas saglabāja savu citosola marķierenzīmu — laktātdehidrogenāzi. Tātad uzņemšanas zudumu nevarēja skaidrot tikai ar saindēšanu vai membrānas plīsumu.

Viens publikācijā minētais piesardzības apsvērums joprojām ir spēkā. Zilie ieslēgumi atradās ap kodolu, bet ne tajā, kas atbilda oksidēšanās norisei subcelulārās organellās, taču pētījumā netika noteikts, kuras tās bija. Līdzīgi raksti citos šūnu tipos bija nosaukti par lizosomāliem, balstoties uz vājiem pierādījumiem. Aizturēšanu uzskatiet par pierādītu, bet tās atrašanās vietu — par pagaidām nenoteiktu. Lasītāji, kuri vēlas izsekot elektronu tālākajam ceļam, var turpināt ar mitohondriju elektronu transportu un oksidēšanās–reducēšanās procesu regulēšanu un plašāku skatījumu uz uzsūkšanos un izkliedi atkarībā no ievadīšanas ceļa.

Krāsojums nav ekspozīcija

Trešais pētījums parāda, kas notiek, kad šī uzņemšanas mehānisma loģika sastopas ar bioloģiskās atbildes mērījumu. Skots un kolēģi atklāja, ka metilbētaciklodekstrīns — gredzenveida cukura molekula ar tora formu — tieši saista metilēnzilo. Iekļāvuma kompleksa asociācijas konstante ir aptuveni 310 uz molāru, salīdzinot ar aptuveni 5846 uz molāru krāsvielas dimerizācijai. L929 fibroblastos šī saistīšanās bloķēja gan šūnu iekrāsošanos, gan glikozes uzņemšanas stimulēšanu: iepriekšēja inkubācija ar ciklodekstrīnu novērsa zilo krāsojumu, bet tā pievienošana pēc iekrāsošanās paātrināja atkrāsošanos. Zilajam optiskajam signālam izzūdot no šūnām, cieši paralēli mazinājās arī aktivētais glikozes transports.

Autori šo korelāciju interpretēja kā atbalstu tiešai mijiedarbībai starp krāsvielu un kādu proteīnu glikozes transportiera aktivēšanas ceļā, nevis ilgstoša oksidatīvā stresa mehānismam. Šis secinājums ir pamatots, taču ierobežots. Eksperiments nenosauc konkrēto proteīnu, nepierāda saistīšanos ar pašu transportieri, un korelācija starp atkrāsošanos un iedarbības zudumu nevar izslēgt visus oksidēšanās–reducēšanās procesu mediētos ceļus.

Galvenā ilgtermiņa atziņa attiecas uz mērīšanu. Optiskais krāsojums atspoguļo redzamo, oksidēto, ar šūnu saistīto krāsvielu. Tas pilnībā neuzrāda bezkrāsainās reducētās formas daudzumu, tāpēc arī bāla šūna var saturēt krāsvielas ekvivalentus, savukārt intensīvi iekrāsota šūna liecina par aizturētu oksidēto krāsvielu, nevis kopējo audu ekspozīciju vai iedarbības apjomu. Tas pats piesardzības princips attiecas arī uz plašākiem salīdzinājumiem: salīdzinot dažādu šūnu tipu krāsojumu vai uzskatot tumšu audu griezumu par lielākas ekspozīcijas pierādījumu, tiek atkārtota sākotnējā kļūda, vērojot šūnas traukā. Uzņemšana ir reducēšanās, difūzijas un atkārtotas oksidēšanās cikls, un jebkurš atsevišķs zilās formas momentuzņēmums parāda tikai vienu tā daļu. No tā tieši izriet praktiskās sekas krāsošanai un darbam laboratorijā, kā arī apgalvojumu par devu un ekspozīciju interpretēšanai.