Krāsošana ar metilēnzilo: mikroskopijas metodes un īstu attēlu atlass

Krāsošana ar metilēnzilo ļauj gaišā lauka mikroskopijā vieglāk atšķirt citādi vāji saskatāmas šūnu struktūras. Tā var palīdzēt skolēniem atrast vaiga gļotādas šūnas kodolu vai izpētīt mikroorganismu kontūras un izkārtojumu. Tomēr zils objekts ir tikai novērojums. Organisma nosaukuma noteikšana, tā izmērīšana un izlemšana, vai tas liecina par slimību, ir atsevišķi uzdevumi.

Vāka attēls ilustrē kontrasta principu. Zemāk esošajā atlantā ir īstas fotogrāfijas ar neatkarīgi dokumentētiem paraugiem un to sākotnējo avotu informāciju.

Ko atklāj metilēnzilais?

Metilēnzilais ir bāziska krāsviela: tās krāsainajam jonam ir pozitīvs lādiņš. Kā OpenStax skaidro sadaļā par paraugu krāsošanu, bāziskās krāsvielas mijiedarbojas ar negatīvi lādētu šūnu materiālu un var izcelt šūnas uz gaišāka fona. Piemērotos preparātos metilēnzilais izceļ ar nukleīnskābēm bagātus apgabalus un citas struktūras, kas saista krāsvielu.

Vienkāršajā krāsošanā kontrastu nodrošina viena krāsviela. Tādēļ dažādi organismi var izskatīties zili, lai gan tie nav viens un tas pats organisms. Sākotnēji noderīgi ir aprakstoši jautājumi: vai objekti ir apaļi vai iegareni, atsevišķi vai sakopoti, vienmērīgi iekrāsoti vai ar atšķirīgām iekšējām daļām? Pirms krāsu interpretējat kā klasifikācijas rezultātu, iepazīstieties ar atšķirību starp vienkāršo krāsošanu un Grama krāsošanu.

Kontrasts un izšķirtspēja ir atšķirīgi jēdzieni. Kontrasts palīdz atšķirt objektu no apkārtnes; izšķirtspēja ļauj nošķirt tuvu esošas detaļas. Tumšāks attēls negarantē, ka tajā var izšķirt vairāk struktūru. Tāpat ne katru tumšu granulu var saukt par organoīdu.

Natīvie preparāti, krāsoti mitrie preparāti un uztriepes

Nekrāsots jeb natīvs mitrais preparāts ļauj novērot paraugu bez pievienotas krāsvielas, lai gan izņemšana no sākotnējās vides tik un tā paraugu maina. Krāsotā mitrajā preparātā reaģentu pievieno, kamēr materiāls zem segstikliņa paliek šķidrumā. Fiksētas uztriepes sagatavošanā materiālu izklāj uz priekšmetstikliņa un pirms turpmākās apstrādes izmanto noteiktu fiksācijas metodi. OpenStax pārskatā par preparātu sagatavošanu mitrie preparāti ir nošķirti no fiksācijas, un ir paskaidrots, kāpēc fiksēti organismi vairs neļauj novērot normālu kustību vai vielmaiņu.

Šie preparāti palīdz atbildēt uz dažādiem jautājumiem:

Salīdzināšanai mācību nodarbībā dokumentējiet nekrāsotu preparātu, pirms pētāt atsevišķu krāsotu preparātu, kas sagatavots saskaņā ar mācību protokolu. Nodrošiniet salīdzināmus apgaismojuma un attēla uzņemšanas iestatījumus. Ja fotografētas divas dažādas šūnas, aprakstiet tās kā piemērus, nevis kā vienas šūnas attēlus pirms un pēc krāsošanas.

Mikroskopijas atlass: trīs īsti krāsoti paraugi

Šis atlass ir oriģināla trīs ar atvērtām licencēm publicētu mikrofotogrāfiju izlase un interpretācija. Avotu autori norāda paraugus un krāsvielas. Mēs neesam neatkarīgi pārbaudījuši viņu paraugu identitāti. Attēli ir reproducēti bez apgriešanas, pārveidojot tos WebP formātā bez zudumiem, nepievienojot detaļas un nemainot krāsas.

1. attēls: cilvēka vaiga gļotādas šūnas

Paraugs: cilvēka vaiga gļotādas šūnas. Krāsviela: metilēnzilais. Palielinājums: 400×, kā norādījis fotogrāfs. Mēroga josla: nav pieejama; avotā nav norādīts kalibrēts pikseļa izmērs. Fotogrāfijas autors Fritzmann2002, 2017, avots Cilvēka vaiga gļotādas šūnas (krāsotas ar metilēnzilo), licence CC BY-SA 4.0. Šai reprodukcijai ir saglabāta tā pati licence.

Sāciet ar atsevišķu šūnu: tās tumšāko kodolu ir vieglāk atšķirt no apkārtējās zilās citoplazmas. Pēc tam izpētiet zem tās esošās šūnas, kas pārklājas. Pārklāšanās apgrūtina robežas izsekošanu un var radīt lokāli tumšāku apgabalu. Izmantojiet šo attēlu, lai vingrinātos izsekot kontūrām, nevis uzskatītu katru tumšu laukumu par kodolu. Vaiga gļotādas šūnu novērošanas ceļvedī šis konkrētajam paraugam paredzētais uzdevums ir izvērsts sīkāk.

2. attēls: sīpola šūnas

Paraugs: sīpola šūnas, kā norādīts avotā. Krāsviela: metilēnzilais. Palielinājums: sākotnējā faila nosaukumā ir norādīts “200x”; tas nav neatkarīgi pārbaudīts. Mēroga josla: nav pieejama; kalibrācija nav norādīta. Fotogrāfijas autors Alvy16, 2019, avots Sīpola šūna 200x, licence CC BY 4.0.

Iegarenie nodalījumi veido sakārtotu slāni. Salīdziniet to garās kopīgās robežas ar neregulārajām kontūrām 1. attēlā. Pievērsiet uzmanību arī uzkrītošajam tumšajam materiālam un nevienmērīgajam redzes lauka gaišumam. Fotogrāfija neļauj noteikt katra tumšā nogulsnējuma identitāti. Tā parāda, kāpēc noderīgā novērojumu pierakstā jāiekļauj artefakti un nenoteiktība, nevis jāpiešķir apzīmējums visam, kas iekrāsojas.

3. attēls: raugs, kas avotā identificēts kā Candida spp.

Paraugs: Candida spp., kā norādījusi fotogrāfe. Krāsošana: vienkārša pozitīvā krāsošana ar metilēnzilo. Palielinājums: nav pieejams. Mēroga josla: nav pieejama; kalibrēts pikseļa izmērs nav norādīts. Fotogrāfijas autore Marta, Wikimedia lietotāja Martunia.g, 2021, avots Pozitīvā krāsošana ar metilēnzilo 2, licence CC BY 4.0.

Salīdziniet blīvos zilos sakopojumus ar mazāk pieblīvētajām malām. Atsevišķu objektu kontūrām ir vieglāk izsekot tur, kur objekti mazāk pārklājas. Nosaukums Candida ir ņemts no avota ieraksta, nevis no sugas identifikācijas, kas veikta pēc šīs fotogrāfijas. Šis attēls arī nesniedz dzīvotspējas novērtējuma rezultātu. Rauga dzīvotspējas un elpošanas testiem ir nepieciešami savi apstākļi, kontroles paraugi un interpretācija.

Pareiza mēroga interpretācija

Šie attēli ir piemēroti vizuālai salīdzināšanai, nevis mērījumiem mikrometros vai šūnu absolūtā izmēra salīdzināšanai starp attēliem. Norādītais palielinājums neaizstāj trūkstošo kameras kalibrāciju. Mainot attēla izmēru ekrānā, mainās tā šķietamais palielinājums.

Saviem attēliem veiciet mērījumu kalibrāciju, izmantojot zināmu etalonu un attiecīgo optisko konfigurāciju. Nikon mikrometrijas ceļvedī ir paskaidrots, kā ar priekšmetmikrometru patvaļīgas attēla vai okulāra skalas iedaļas pārvērst fiziskos garumos. Pierakstiet objektīvu, kameras konfigurāciju un kalibrāciju un pievienojiet mēroga joslu, balstoties uz šiem datiem. Neveidojiet mēroga joslu pēc mācību grāmatā norādīta vidējā šūnas izmēra.

Vai pudeles saturs atbilst metodei?

Pudele ar uzrakstu „metilēnzilais” nav pilnīga laboratorijas specifikācija. Pārbaudiet koncentrāciju un mērvienības, šķīdinātāju, papildu sastāvdaļas, paredzēto lietojumu, partijas dokumentāciju un instrukcijas. Reaģenta drošības datu lapa apraksta bīstamību; metodes instrukcijas nosaka, kā to izmantot paredzētā preparāta sagatavošanai.

Konkrēts piemērs ir Merck Lēflera metilēnzilā šķīdums. Ražotājs to norāda kā mikroskopijas reaģentu un apraksta tā izmantošanu papildu krāsošanai skābizturīgo mikroorganismu krāsošanas metodē. Norādītā uzliesmojamība arī parāda, kāpēc apzīmējums „zils šķidrums” nesniedz pietiekamu informāciju, lai plānotu darbu ar to vai tā karsēšanu. Šīs īpašības attiecas uz šo sastāvu, nevis automātiski uz ikvienu metilēnzilā ūdens šķīdumu.

Tāpat eozīna un metilēnzilā agars ir barotne ar noteiktu sastāvu. Tā nav priekšmetstikliņa preparāta krāsviela, ko iegūst, paraugam pievienojot tikai metilēnzilo. Ja attēlveidošanas mērķis ir cits, salīdziniet metilēnzilā alternatīvas mikroskopijā.

Ja izmantojat iesācēja mikroskopa komplektu, sāciet ar tā dokumentēto mācību metodi, zināmiem gatavajiem preparātiem un norādīto reaģentu. Ja pudelei ir pazudusi etiķete vai tās saturu nevar noteikt, aizstājiet to ar atbilstošu dokumentētu reaģentu. Izmantojiet acu aizsarglīdzekļus un ievērojiet norādījumus darbam ar konkrēto sastāvu. Strādājot ar cilvēka izcelsmes materiālu un nezināmiem vides paraugiem, jāievēro mācību laboratorijas paraugu apstrādes un utilizācijas procedūras; krāsošana šīs procedūras neaizstāj.

Pierakstiet novērojumu pirms secinājuma

„Zili ovāli objekti sakopojumos” ir pamatots attēla apraksts. Apgalvojumam par „konkrētu infekciju” nepieciešami pierādījumi, ko attēls nav sniedzis. Pierakstos atsevišķi norādiet parauga izcelsmi, sagatavošanu, krāsošanas reakciju un identifikācijas metodi. Šāds nošķīrums padara vienkāršu mācību attēlu noderīgu un neļauj pievilcīgai mikrofotogrāfijai kļūt par pamatu apgalvojumam, ko tā nevar pamatot.