Metileno mėlynojo sugerties spektras ir molinis sugerties koeficientas: žinynas su nurodytomis sąlygomis

Metileno mėlynojo spektras atrodo paprastas, kol nepabandote iš jo paimtos skaitinės vertės panaudoti kitur. Viena laboratorija nurodo molinį ekstinkcijos koeficientą, artimą 82,000. Kita nurodo 67,000. Trečia – daugiau kaip 100,000. Visos trys vertės gali teisingai apibūdinti atitinkamus matavimus, tačiau nė viena nėra universali šio dažiklio konstanta.

Painiava kyla suplakus dvi skirtingas sąvokas. Optinis tankis yra konkretaus tirpalo konkrečioje kiuvetėje matavimo rezultatas. Molinis sugerties koeficientas, dažnai žymimas epsilon, yra to tirpalo modelio parametras. Kai keičiasi metileno mėlynojo asociacijos būsena, keičiasi modelis, todėl keičiasi ir parametras. Naudinga kiekvieną koeficientą laikyti verte su nurodytomis sąlygomis: kartu su skaičiumi turi būti pateikiamas bangos ilgis, tirpiklis, pH arba buferis, temperatūra, koncentracijų intervalas ir optinio kelio ilgis.

Monomero juosta praskiestame vandeniniame tirpale

Praskiestame vandeniniame tirpale vyraujanti metileno mėlynojo katijono juosta yra ties maždaug 664–665 nm; priklausomai nuo prietaisų ir kalibravimo pasirinkimų, dažnai nurodomas 664–668 nm intervalas. Ši juosta tinkama kiekybiniam nustatymui, kai tirpalas pakankamai praskiestas, kad didžioji dažiklio dalis būtų monomerinės formos.

Trys literatūroje pateiktos vertės rodo, kodėl sąlygos svarbesnės už patį skaičių. Molį tyrę mokslininkai, kurių vandeninių mėginių koncentracija 1 cm kiuvetėse buvo mažesnė nei maždaug 7 mikromoliai litre, nurodė maždaug 82,000 M-1 cm-1 epsilon vertę ties 665 nm. Ši vertė itin gerai dokumentuota kaip labai praskiestų vandeninių mėginių empirinės kalibravimo tiesės nuolydis. Vėlesnis pirminis kalibravimas dejonizuotame vandenyje, naudojant 2.34–37.52 mikromolio litre koncentracijas ir 1 cm optinį kelią, davė maždaug 67,100 M-1 cm-1 vertę ties 665 nm bendram dažiklio kiekiui. Mažesnis rezultatas yra tikėtinas, o ne prieštaringas, nes viršutinėje šio kalibravimo intervalo pusėje jau yra nemaža dimero dalis. Trečioji vertė, maždaug 73,460 M-1 cm-1 ties 664 nm, gauta tyrime, atliktame esant pH 6.86 ir 293 K, kuriame stebėtas spektras buvo išskaidytas į monomero ir dimero dalis, kaip apibendrinta naujausioje kritinėje metileno mėlynojo fotofizikos apžvalgoje. Šis skaičius apibūdina dekonvoliucijos būdu išskirtą monomero komponentą, o ne tiesioginį optinio tankio priklausomybės nuo bendros dažiklio koncentracijos nuolydį.

Praktinė išvada: pasirinkite koeficientą, kurio sąlygos atitinka jūsų mėginius, arba atlikite savo kalibravimą. Nenaudokite 82,000 vertės 30 mikromolių litre koncentracijos analizei fosfatiniame buferyje manydami, kad tiesiškumas vis dar galioja.

Trumpųjų bangų petys yra kelių komponentų suma

Didėjant koncentracijai, petys ties maždaug 600–615 nm didėja, palyginti su 664 nm smaile. Šiuolaikiniuose tyrimuose H tipo dimero indėlis paprastai priskiriamas maždaug 605–610 nm sričiai. Globalioji metileno mėlynojo vandenyje spektrinė analizė išskiria dimero maksimumą ties 607 nm ir aukštesnės eilės agregato maksimumą ties 600 nm, o monomero rezonansinius komponentus – ties 664 ir 650 nm. Visas tekstas prieinamas per atvirosios prieigos įrašą PMID 33251415.

Šio peties nereikėtų vadinti grynojo dimero optiniu tankiu. Toje pačioje srityje taip pat prisideda monomero vibroninė struktūra, todėl išmatuotas aukštis yra kelių indėlių superpozicija. Vienas globalusis modelio pritaikymas parodė, kad monomero ir dimero modelis netiko visam koncentracijų intervalui nuo 1.1 mikromolio litre iki 3.4 milimolio litre, o įtraukus tetramerą gauta geriausia atitiktis; tetramero signalas jau buvo aptinkamas esant mažesnei nei 34 mikromolių litre koncentracijai. Modeliu nustatyti komponentų koeficientai buvo dideli: maždaug 107,800 M-1 cm-1 ties 664 nm pagrindiniam monomero komponentui, maždaug 101,400 dimerui ties 607 nm ir maždaug 138,500 tetramerui ties 600 nm nebuferizuotame dejonizuotame vandenyje, kai natrio chlorido koncentracija buvo nuo 0 iki 0.15 M, o temperatūra – nuo 282 iki 333 K. Tai modeliu išskirti komponentai, todėl jais negalima pakeisti empirinio Bero–Lamberto priklausomybės nuolydžio.

Dimerizacijos stiprumas buvo kiekybiškai nustatytas tiesiogiai. Esant pH 6.86 ir 293 K, viename tyrime gauta dimerizacijos konstanta, artima 3,900 M-1. Tokia vertė paaiškina, kodėl 5 mikromolių litre darbinio tirpalo priklausomybė yra beveik tiesinė, o 50 mikromolių litre pradinio tirpalo – ne. Kuriant metodą naudinga tikrinti optinio tankio ties maždaug 610 nm ir optinio tankio ties maždaug 665 nm santykį. Kai šis santykis didėja kartu su koncentracija, epsilon ties 664 nm nebeapibūdina vienos nekintančios cheminės formos.

Koncentracijų intervale, kuriame vyrauja viena tarpusavyje virstančių formų pora, spektrai gali turėti bendrą izosbestinį tašką; vandeninių tirpalų serijose eksperimentiškai jis stebimas ties maždaug 625 nm. Aiškus nekintantis taškas dera su dviejų vyraujančių formų buvimu. Kai didėjant koncentracijai taškas pasislenka arba išnyksta, laikykite tai įspėjimu, kad atsirado aukštesnės eilės agregatų arba pasislinko pusiausvyros, o ne prietaiso paklaida.

Tirpiklis, pH ir temperatūra keičia spektrą

Vanduo skatina asociaciją. Pridėjus dimetilsulfoksido, dimerizacija slopinama, sugerties ir fluorescencijos maksimumai pasislenka į ilgesnių bangų sritį, o fluorescencijos kvantinė išeiga padidėja maždaug keturis kartus, kaip nurodyta metileno mėlynojo tyrime vandens ir DMSO mišiniuose, indeksuotame kaip PMID 30933781. Šiame darbe vandeninių tirpalų spektrai nagrinėjami kaip monomero ir dimero pusiausvyra, kai monomero sugertis yra ties maždaug 650–670 nm, o dimero – ties maždaug 580–615 nm; dimerizacijos konstantos apskaičiuojamos iš spektrų esant 293.15 K.

Alkoholiai keičia ir padėtį, ir regimąjį stiprumą, tačiau agregacijos nepanaikina. Viename pirminiame palyginime, atliktame esant 31.3 mikromolio litre koncentracijai ir kambario temperatūrai bei aprašytame metileno mėlynojo tirpiklių tyrime, ilgųjų bangų maksimumas vandenyje buvo ties 665 nm, o metanolyje – ties 655 nm; regimosios viso tirpalo koeficiento vertės buvo artimos 37,100 vandenyje ir 60,800 metanolyje. Atskiras patvirtinamasis tyrimas absoliučiajame etanolyje esant 298 K parodė maksimumą ties 655 nm ir epsilon vertę, artimą 68,000.

Įprasti pH pokyčiai spektrą keičia mažiau, nei numanoma daugelyje protokolų. Pirmiau minėtoje kritinėje apžvalgoje nurodoma, kad nuo maždaug pH 2 iki pH 12 maksimumas išliko ties maždaug 665 nm, o iki pH 11 intensyvumas kito tik nežymiai. Buferio sudėtis ir joninė jėga gali paveikti rezultatus tiek pat, kiek nominalusis pH, todėl užrašykite faktiškai naudotą buferį ir druską, o ne vien pH matuoklio rodmenį. Stipri rūgštis ar stiprus šarmas yra atskiras atvejis, nes dažiklis gali chemiškai pakisti, užuot dalyvavęs grįžtamojoje asociacijoje. Temperatūra ir druska taip pat keičia pusiausvyrą, todėl 2020 m. tyrime vandenyje abu šie veiksniai buvo sąmoningai keičiami.

Matavimas, užtikrinantis vertės tinkamumą

Kiekybiniai tyrimai grindžiami Bero–Lamberto dėsniu: optinis tankis lygus epsilon, koncentracijos ir optinio kelio ilgio sandaugai. Taip pat būtina įrodyti, kad tiesinė priklausomybė jūsų sąlygomis iš tiesų galioja.

Tirdami mažas mikromolines koncentracijas naudokite 1 cm kiuvetę. Kai epsilon artimas 82,000, esant 5 mikromolių litre koncentracijai optinis tankis yra maždaug 0.41, o esant 10 mikromolių litre – maždaug 0.82. Jei matuojate daugiausia monomerą paprastame vandenyje, saugiau laikytis maždaug 5–7 mikromolių litre ar mažesnės koncentracijos, nei kalibruoti gerokai į dešimčių mikromolių litre sritį. Koncentruotiems pradiniams tirpalams trumpinkite optinį kelią, užuot priėmę gerokai didesnį nei 1 optinį tankį.

Tuščiajam mėginiui naudokite identišką matricą: tos pačios kokybės vandenį, tą pačią papildomo tirpiklio dalį, tą patį buferį ir druskas, tik be dažiklio. Kalibravimo tirpalus ruoškite toje pačioje matricoje ir palaikykite tą pačią temperatūrą. Kurdami metodą nuskenuokite visą regimosios šviesos diapazoną, geriausia maždaug 550–750 nm, o ne matuokite vienu bangos ilgiu. Stebėkite ne tik aukštį, bet ir formą. Jei nuosekliai skiedžiant kinta normalizuota spektro forma, sistemos cheminė būsena priklauso nuo koncentracijos. Stabilus maksimumas ir stabilus optinių tankių ties 610 ir 665 nm santykis yra tvirtesni tinkamo intervalo įrodymai nei vien didelė R kvadratu vertė.

Dokumentuokite reagento formą. Komercinė medžiaga gali būti bevandenis metiltioninio chloridas arba hidratas, pavyzdžiui, trihidratas, todėl pradinių tirpalų skaičiavimams naudojama molinė masė turi atitikti tai, kas iš tiesų yra buteliuke. Vien šis žingsnis paaiškina dalį nominaliųjų molinių koncentracijų neatitikimų tarp laboratorijų. Tokios pat drausmės reikia, kai rezultatai naudojami kiekybinės analizės skaičiavimams, spektrai padeda tikrinti formulės stabilumą, o priemaišų profiliai reikalauja grynumo ir specifikacijų peržiūros.

Santrauka su nurodytomis sąlygomis

Šią lentelę naudokite kaip pradinį laboratorinio įrašo šabloną, o ne kaip tarpusavyje pakeičiamų konstantų šaltinį.

Taigi metileno mėlynojo sugerties bangos ilgis yra trumpas atsakymas su ilga išnaša. Nurodykite išmatuotą maksimumą, tirpalą, kuriame jį matavote, ir koncentraciją, kuriai esant matavote. Šis įprotis neleidžia vienai praskiesto vandeninio tirpalo vertei ties maždaug 664 nm virsti klaidinga universalia konstanta.