Metileno mėlynasis insulto ir smegenų hipoperfuzijos tyrimuose: ką iš tikrųjų rodo trys modeliai

Užsikimšusi arterija, maisto medžiagų stokojanti ląstelių kultūra ir žiurkė su susiaurėjusiomis kaklo arterijomis gali atrodyti kaip trys to paties eksperimento variantai. Tačiau taip nėra. Kiekvienu atveju keliamas skirtingas klausimas, ir kiekviename metileno mėlynasis pateikia skirtingą atsakymą. Juos supainiojus, mokslinė literatūra atrodo prieštaringa. Juos atskyrus, išryškėja aiškus dėsningumas, kurį daugiausia lemia skyrimo laikas.

Būtent šis atskyrimas yra pagrindinis apžvalgos tikslas. Trys modeliai – tai ūminis židininis insultas, deguonies ir gliukozės stoka su vėlesniu deguonies tiekimo atkūrimu kultivuojamose ląstelėse bei kelias savaites trunkanti lėtinė smegenų hipoperfuzija. Siūlomas juos siejantis mechanizmas susijęs su mitochondrijomis, tačiau rezultatai skiriasi, nes skiriasi metabolinės sąlygos.

Trys modeliai atsako į skirtingus klausimus

Ūminis židininis insultas žiurkėms paprastai sukeliamas užkemšant vidurinę smegenų arteriją; tai sutrumpintai vadinama MCAO. Į krešulį panaši kliūtis sukuria išeminį branduolį, apsuptą penumbros – audinio, kuriam gresia pažeidimas, bet kurį dar galima išgelbėti atkūrus kraujotaką. Šiuo atveju klausiama, ar intervencija sulėtina infarkto plitimą arba išsaugo funkciją prieš reperfuziją ir po jos.

Deguonies ir gliukozės stokos modelis, sutrumpintai OGD, veikia visai kitu mastu. Kultivuojamos smegenų ląstelės laikomos aplinkoje, kurioje beveik nėra deguonies ir nėra gliukozės, o paskui grąžinamos į įprastą terpę. Čia nėra nei krešulio, nei kolateralinės kraujotakos, nei kraujospūdžio, nei imuninės sistemos. Klausimas susijęs tik su ląstelėmis: kas nutinka jų kvėpavimui, ATP ir išgyvenamumui, kai substratai išnyksta, o paskui vėl tampa prieinami.

Lėtinė smegenų hipoperfuzija žiurkėms sukeliama nuolatine abipuse miego arterijų okliuzija; tai vadinama 2VO modeliu. Priekinių smegenų kraujotaka sumažėja ir išlieka maža kelias savaites. Nėra staigaus židininio infarkto ir skubios reperfuzijos. Klausiama, ar kelias savaites teikiama metabolinė parama išsaugo kraujagysles, mitochondrijas ir atmintį esant ilgalaikiam kraujotakos sumažėjimui.

Todėl atminties pagerėjimas po vieno mėnesio gydymo 2VO modelyje tiesiogiai nieko nepasako apie žmogaus smegenų išgelbėjimą atliekant skubią trombektomiją. Šis skirtumas svarbus, nes dauguma optimistinių santraukų jį praleidžia.

Ūminis insultas: apsauga reperfuzijos metu, pažeidimo atitolinimas be jos

Aiškiausias ūminio modelio rezultatas gautas taikant laikiną MCAO su reperfuzija. Žiurkėms okliuzija truko 60 minučių, tada, prasidėjus reperfuzijai, į veną pradėta leisti mažą metileno mėlynojo dozę; papildomos dozės skirtos po 3 valandų ir 2 dieną. MRT parodė, kad tirpiklio kontrolinėje grupėje pažeidimas iki 2 dienos padidėjo maždaug 19 procentų, o gydytoje grupėje sumažėjo maždaug 17 procentų; galutiniai infarktai buvo maždaug 30 procentų mažesni, o neurologinių skalių įverčiai 2 ir 7 dienomis – geresni. Vaizdiniuose tyrimuose nustatytas geresnis tiek branduolio, tiek penumbros audinio išlikimas. Platesnėje neuroprotekcijos literatūroje ši su reperfuzijos laiku susieta apsauga aptariama kartu su visuotinės išemijos ir traumos tyrimų rezultatais.

Vaizdas pasikeičia, kai arterija lieka užsikimšusi. Nuolatinės MCAO eksperimente vykstant išemijai skirtas metileno mėlynasis sulėtino pagal difuzijos vaizdus nustatomo pažeidimo plitimą ir trumpam pratęsė perfuzijos bei difuzijos neatitikties trukmę, šiek tiek pagerindamas vietinę kraujotaką, tačiau galutinis infarkto tūris po 24 valandų reikšmingai nesiskyrė. Jis atitolino pavojuje esančio audinio virtimą infarktu, bet nepakeitė kraujagyslės atvėrimo.

Trečias ūminio modelio tyrimas papildo vaizdą mechanizmo ir dozės niuansais. Vienkartinė dozė, suleista į pilvaplėvės ertmę iškart po okliuzijos, labiausiai sumažino infarktą – maždaug 50 procentų – skiriant tarpinę 5 mg/kg dozę, o ne 1 ar 10 mg/kg; kartu pagerėjo sensomotorinių funkcijų įverčiai. Autoriai tai susiejo su išsaugota mitochondrijų struktūra ir sustiprėjusia mitofagija – selektyviu pažeistų mitochondrijų pašalinimu. Taigi svarbi dozė, vartojimo būdas ir skyrimo schema, o žiurkėms taikomos mg/kg vertės nėra dozės žmonių insultui gydyti.

Ląstelių kultūra: ta pati medžiaga padeda arba kenkia priklausomai nuo to, kada patenka

Astrocitų eksperimentas yra vienas informatyviausių ir dažniausiai netiksliai cituojamų. Pirminiai pelių smegenų žievės astrocitai 6 valandas buvo laikomi didelės stokos sąlygomis: esant 0.1 procento deguonies koncentracijai terpėje be gliukozės, piruvato ir serumo. Po to 24 valandoms buvo atkurtas deguonies tiekimas ir substratų prieinamumas. Maždaug pusė ląstelių žuvo, todėl bandymas galėjo parodyti tiek teigiamą, tiek neigiamą poveikį.

Kai metileno mėlynojo buvo stokos fazėje, išgyvenamumas pablogėjo, o ne pagerėjo. Kai jis buvo pridėtas tik atkuriant deguonies tiekimą, mažos mikromolinės koncentracijos pagerino gyvybingumą ir padidino deguonies suvartojimą, gliukozės pasisavinimą bei ATP gamybą. Įprastomis sąlygomis tos pačios koncentracijos padidino gliukozės pasisavinimą maždaug 89 procentais esant 0.1 mikromolinei koncentracijai ir maždaug 200 procentų esant 1 mikromolinei koncentracijai; po pažeidimo buvo išsaugotos glikogeno atsargos ir heksokinazės aktyvumas, o išmatuoto superoksido kiekio padidėjimo nenustatyta.

Mechanizmą lengviau suprasti palyginus jį su atsarginiu generatoriumi. Metileno mėlynasis veikia kaip alternatyvus elektronų pernešiklis, priimantis redukcinius ekvivalentus ir perduodantis juos citochromui c bei IV kompleksui. Tai palaiko elektronų srautą ir ATP sintezę bei mažina elektronų nuotėkį ankstesnėse grandinės dalyse. Esant didelei stokai, toks stimuliavimas tampa trūkumu, nes didina metabolinį poreikį tada, kai deguonies ir gliukozės beveik nėra, todėl paskutinės atsargos gali išsekti greičiau. Substratams vėl tapus prieinamiems, ta pati savybė tampa pranašumu, nes padeda pažeistoms mitochondrijoms veiksmingai naudoti vėl tiekiamą deguonį ir gliukozę. Todėl ir paaiškinimus apie elektronų pernašą mitochondrijose būtina vertinti atsižvelgiant į stokos sąlygas.

Viena išlyga: ši skyrimo laiko taisyklė galioja būtent tam astrocitų preparatui. Susijusiame ląstelių tyrime, kuriame naudotas kitas ląstelių tipas, švelnesnės stokos sąlygos ir mažesnė koncentracija, apsauga nustatyta net tada, kai medžiaga veikė stokos metu. Ląstelių tipas, likęs deguonies kiekis, koncentracija ir protokolas lemia, ar poveikis bus teigiamas, ar neigiamas.

Lėtinis kraujotakos sumažėjimas: atmintis, citochromo oksidazė ir kraujagyslės per kelias savaites

Lėtinių modelių eksperimentuose mažos dozės buvo skiriamos kasdien kelias savaites, o ne vienu skubiu boliusu. Pirmajame tyrime žiurkėms su nuolatine miego arterijų okliuzija vieną mėnesį kasdien buvo skiriama 4 mg/kg po kiekvieno kasdienio mokymosi užsiėmimo, siekiant paveikti atminties konsolidaciją, o ne momentinį užduoties atlikimą. Gyvūnai su okliuzija lėčiau išmoko vizualinio atskyrimo užduotis ir prasčiau atliko sudėtingą atminties testą, tačiau plaukimo gebėjimas, motorinis aktyvumas ir kvapų atpažinimas nepakito. Kasdienis gydymas sumažino mokymosi ir atminties sutrikimus, nekeisdamas bendro motorinio elgesio.

Tolesniame tyrime po tos pačios vieno mėnesio skyrimo schemos buvo įvertintas citochromo oksidazės, kuri yra mitochondrijų IV kompleksas, aktyvumas 44 smegenų srityse. Okliuzija sumažino fermento aktyvumą regos, prefrontalinėje ir peririnalinėje žievėje, taip pat hipokampe bei migdoliniame kūne ir susilpnino suderintą regos žievės bei hipokampo aktyvumą. Gydymas išsaugojo fermento aktyvumą atskirose srityse ir sustiprino šias tarpsritines metabolines koreliacijas, o išsaugotas aktyvumas koreliavo su geresniu užduočių atlikimu. Šios koreliacijos apibūdina suderintą metabolinio fermento aktyvumą, o ne tiesioginius žmogaus smegenų funkcinio junglumo matavimus – šį skirtumą padeda aiškiai suprasti smegenų energijos apykaitos apžvalgos.

Atskirame vienos savaitės tyrime kasdien buvo skiriama 2 mg/kg, o mechanizmui patikrinti pridėtas signalinio kelio inhibitorius. Gydymo metu smegenų kraujotaka padidėjo nuo maždaug 60 iki maždaug 100 mL per 100 g per minutę, o hipokampo kraujagyslių tankis – nuo maždaug 15.1 iki 23 procentų. Užblokavus PI3K/Akt ląstelių išgyvenimo signalinį kelią, abu pagerėjimai iš dalies sumažėjo; gydymo metu taip pat padidėjo fosforilinto Akt kiekis. Kraujotakos, kraujagyslių tankio, barjero ir neuronų tyrimų rezultatai rodo neurovaskulinę apsaugą, susijusią su PI3K/Akt signalų perdavimu, o ne vien metabolinį poveikį.

Kodėl nė vienas iš šių rezultatų neprilygsta skubiajai pagalbai insulto atveju

Kontroliuojamos laboratorinės sąlygos yra priežastis, dėl kurios šių rezultatų negalima tiesiogiai perkelti į klinikinę praktiką. Kultivuojamos ląstelės neturi nei trombo, nei farmakokinetikos. 2VO modelis reiškia ilgalaikį visuotinį kraujotakos sumažėjimą, o ne staigų židininį embolą su vos prieš kelias minutes susidariusia penumbra. Net žiurkių MCAO modelyje naudojami jauni sveiki gyvūnai, anestezija, vienodos okliuzijos ir tiksliai suplanuotas dozių skyrimas – kitaip nei vyresnių pacientų atveju, kai skiriasi krešuliai, būna aterosklerozė, hipertenzija, diabetas ir nežinomas simptomų pradžios laikas.

Nė vienas paskelbtas atsitiktinių imčių tyrimas su žmonėmis nėra patvirtinęs metileno mėlynojo kaip skubaus ūminio išeminio insulto gydymo. Kartais cituojamame žmonių smegenų vaizdinimo tyrime dalyvavo 26 sveiki suaugusieji, o ne insultą patyrę pacientai; vienkartinė geriamoji dozė pakeitė su užduotimi susijusius smegenų signalus ir šiek tiek pagerino informacijos atgaminimą iš atminties. Tai rodo poveikį centrinei nervų sistemai, o ne veiksmingumą insulto atveju. Dabartinėse skubiosios pagalbos rekomendacijose daugiausia dėmesio skiriama greitai reperfuzijai taikant intraveninę trombolizę tinkamiems pacientams ir trombektomiją tinkamais stambiųjų kraujagyslių okliuzijos atvejais, o standartiniai skubiosios pagalbos algoritmai insulto atveju tebėra vienintelis įrodytas kelias. Įtarus insultą, pagalbos niekada negalima atidėti dėl metileno mėlynojo skyrimo, o praktiniai ikiklinikinių dozių ekstrapoliavimo apribojimai paaiškina, kodėl žiurkėms taikytų schemų negalima laikyti klinikiniais režimais.

Saugumo aspektai dar labiau pabrėžia šią ribą. Intraveninio metileno mėlynojo informacijoje pateikiamas įrėmintas įspėjimas apie sunkų arba mirtiną serotonino sindromą, kai jis vartojamas kartu su serotoninerginiais vaistais, įskaitant SSRI, SNRI ir MAO inhibitorius, kuriuos vartoja daugelis insultui būdingo amžiaus pacientų. Jis kontraindikuotinas esant G6PD trūkumui dėl hemolizės rizikos. Jis taip pat slopina azoto monoksido signalų perdavimą, o tai tam tikromis sąlygomis didina kraujagyslių pasipriešinimą ir kraujospūdį, todėl jo nederėtų apibūdinti tiesiog kaip vaisto, didinančio smegenų kraujotaką. Patvirtintas 1 mg/kg intraveninis režimas įgytai methemoglobinemijai gydyti nėra insulto gydymo režimas.

Sąžininga išvada yra ribota, bet pagrįsta. Esant laikinai židininei išemijai, reperfuzijos laikotarpiu skiriamas mažos dozės metileno mėlynasis sumažino pažeidimo progresavimą žiurkėms. Esant nuolatinei okliuzijai, jis atitolino infarktą, bet jo neapsaugojo. Astrocitams jis kenkė didelės stokos metu ir padėjo atkuriant deguonies tiekimą. Lėtinės hipoperfuzijos metu jis kelias savaites padėjo išsaugoti citochromo oksidazę, kraujagysles ir atmintį. Vienas elektronų pernešiklis, trys kontekstai, trys atsakymai.