Metileno mėlynasis ir Bartonella: laboratorinių tyrimų rezultatai ir klinikinių įrodymų ribos

Kultūros lėkštelę ir pacientą sieja tas pats žodis – infekcija, tačiau jo reikšmė skiriasi. Lėkštelėje infekcija reiškia kolonijų skaičių ant agaro. Paciento organizme tai bakterijos ląstelėse ir kraujagyslėse, krauju ir audiniais judantys vaistai bei imuninė sistema, atliekanti dalį darbo. Supainiojus šiuos du dalykus, įspūdingas laboratorinis skaičius ima atrodyti kaip gydymo metodas. Juos atskyrus, tas pats skaičius tampa tuo, kuo ir yra: priežastimi atlikti kitą eksperimentą.

Šis atskyrimas yra pagrindinis šios metileno mėlynojo ir Bartonella apžvalgos tikslas. Vienos tyrėjų grupės atliktuose dviejuose laboratoriniuose tyrimuose metileno mėlynasis buvo tiriamas prieš nesidauginančias Bartonella henselae. Abiejuose nustatytas stiprus aktyvumas stikliniuose ir plastikiniuose induose. Nė viename jis nebuvo tirtas su žmonėmis.

Kodėl tyrėjai tiria stacionariąją fazę

Daugumoje antibiotikų tyrimų naudojamos besidauginančios ląstelės. Toks modelis neapima sudėtingesnio atvejo: ląstelių, kurios nustojo dalytis ir toleruoja vaistus, naikinančius jų besidauginančias giminaites.

Bartonella gali išlikti organizme, taip pat eritrocitų ir endotelio ląstelių viduje. Todėl tyrėjų grupė siekė nustatyti, kurie patvirtinti vaistai gali sunaikinti B. henselae, kai jos pereina į stacionariąją fazę. Maža minimali slopinamoji koncentracija (MIC), nustatyta besidauginančioms ląstelėms, neprognozavo stacionariosios fazės ląstelių sunaikinimo. Rifampino MIC buvo labai maža, tačiau jis prastai naikino stacionariosios fazės ląsteles, o junginiai, kurių MIC vertės buvo didesnės, jas naikino gerai. Skaitytojai, ieškantys bendro metodo tokiems straipsniams vertinti, jį ras metileno mėlynojo tyrimų skaitymo vadove.

Pirmoji atranka: Li ir kolegos, 2019

2019 m. stacionariosios fazės atrankiniame tyrime, paskelbtame žurnale Antibiotics, naudota viena padermė – B. henselae JK53. Ji auginta Schneider terpėje su 10 procentų vaisiaus galvijų serumo, 37 C temperatūroje ir esant 5 procentams CO2. Vienos dienos kultūrose daugiausia buvo pasklidusių besidalijančių ląstelių. Penkių dienų kultūros, kuriose buvo maždaug 10 laipsniu 8 kolonijas sudarančių vienetų viename mL, laikytos stacionariosios fazės kultūromis; jose buvo matomų agregatų.

Tyrimui naudotas SYBR Green I su propidžio jodidu, kalibruotas pagal gyvų ir izopropanoliu sunaikintų ląstelių mišinius. Kadangi metileno mėlynasis yra intensyvios spalvos, atrankoje nustatyti aktyvūs junginiai buvo patikrinti mikroskopuojant, o vėliau – skaičiuojant kolonijas ant kraujo agaro. Tai griežtesnis vertinimo kriterijus.

Ištyrus 1,581 patvirtintą vaistą esant 50 mikromoliarinei koncentracijai, po metileno mėlynojo poveikio liko 16 procentų gyvybingų ląstelių pagal plokštelių skaitytuvo duomenis ir 25 procentai pagal mikroskopijos duomenis. Daptomicino rezultatas buvo 21 procentas, kelių azolų – nuo 22 iki 27 procentų, gentamicino – 32 procentai, eritromicino – 66 procentai, ciprofloksacino – 74 procentai. Pagal skaitytuvo duomenis pirvinio pamoatas atrodė stipresnis, tačiau jo nebuvo galima įvertinti mikroskopuojant dėl paties junginio fluorescencijos.

Besidauginančių B. henselae atveju metileno mėlynojo MIC buvo nuo 0.08 iki 0.16 mikrogramų viename mL. Veikiant penkių dienų stacionariosios fazės ląsteles 5 mikrogramų viename mL koncentracija, po vienos poveikio dienos kolonijų nebeaptikta. Toks pat rezultatas gautas naudojant daptomiciną ir pirvinio pamoatą jų tirtomis koncentracijomis. Atskirame bakterijų žuvimo priklausomybės nuo laiko tyrime naudota 10 mikrogramų viename mL koncentracija. Tai laboratorinės poveikio koncentracijos, o ne dozės, ir straipsnyje jos taip ir pateikiamos. Straipsnyje nurodyta maždaug 3.9 mikrogramų viename mL didžiausia koncentracija žmogaus plazmoje pateikiama tik kaip bendras kontekstas. Metileno mėlynojo farmakokinetikos apžvalgoje paaiškinama, kodėl koncentracijos plazmoje negalima laikyti koncentracija audiniuose.

Straipsnyje aiškiai įvardijami du ribotumai. Nebuvo nei bioplėvelės modelio, nei metileno mėlynojo derinių tyrimų. Penkių dienų agregatai buvo sankaupos stacionariosios fazės skystoje kultūroje, o ne patvirtintas bioplėvelės eksperimentinis modelis. Autoriai paragino atlikti tyrimus su gyvūnais, tirti derinius, bioplėveles ir kitas Bartonella rūšis.

Deriniai ir iš bioplėvelės išskirtos ląstelės: Zheng ir kolegos, 2020

2020 m. tęstiniame tyrime, paskelbtame žurnale BMC Microbiology, išlaikyta ta pati padermė ir terpė, tačiau naudotos šešių dienų stacionariosios fazės kultūros ir pridėti du dalykai, kurių trūko pirmajame straipsnyje: dviejų vaistų deriniai ir iš bioplėvelės išskirtų ląstelių modelis.

Tiriant pavienius vaistus vienoda 5 mikrogramų viename mL koncentracija 24 valandas, po metileno mėlynojo poveikio liko 3.2 kart 10 laipsniu 4 kolonijas sudarančių vienetų viename mL, palyginti su maždaug 2.8 kart 10 laipsniu 10 kontrolinėje kultūroje. Po ciprofloksacino, gentamicino ir nitrofurantoino poveikio tuo pačiu metu liko mažiau kolonijų. Tai skiriasi nuo 2019 m. rezultato, kai esant tai pačiai nominaliai koncentracijai po vienos dienos kolonijų nebeaptikta. Skyrėsi kultūrų amžius, tankis ir tvarkymo procedūros, todėl bakterijų naikinimo poveikis pasikartojo, tačiau jo mastas nebuvo vienodas. Šis rezultatų skirtumas tarp bandymų yra viena priežasčių, kodėl atliekant įprastas saugumo ir sąveikų patikras laboratorinis aktyvumas vertinamas atskirai nuo klinikinio poveikio.

Derinių atranka yra dažniausiai cituojama tyrimo dalis. Kiekvieno komponento koncentracija buvo fiksuota – 5 mikrogramai viename mL. Tiek azitromicino ir metileno mėlynojo, tiek rifampino ir metileno mėlynojo deriniai po 24 valandų nepaliko aptinkamų stacionariosios fazės kolonijų. Toks pats rezultatas gautas su abiem ciprofloksacino deriniais; iš 25 tirtų porų taip veikė tik šios keturios. Formali sinergijos analizė neatlikta, todėl tinkamas terminas yra šiomis sąlygomis aktyvus derinys, o ne įrodyta sinergija.

Bioplėvelės eksperimente tirtos ląstelės, išskirtos iš jaunos suardytos bioplėvelės, o ne prasiskverbimas į nepažeistą brandžią bioplėvelę. Kultūros augintos penkias dienas, praskiestos ir perkeltos į plokštelių šulinėlius dar penkioms dienoms. Bioplėvelės susidarymas patvirtintas dažant kristaliniu violetu, o prieš vaistų poveikį ji nugrandyta. Esant 5 mikrogramų viename mL koncentracijai, po vien metileno mėlynojo poveikio kolonijų skaičius iki 6 dienos sumažėjo iki 2.3 kart 10 laipsniu 2. Tai buvo vienas geriausių pavienių preparatų rezultatų, tačiau ne nulis. Abu metileno mėlynojo deriniai iki 6 dienos pasiekė nulį, kaip ir abu ciprofloksacino deriniai.

Autoriai nurodė tuos pačius ribotumus, kuriuos pastebėtų atidus skaitytojas: jauna nugrandyta bioplėvelė, o ne sena nepažeista bioplėvelė; viena patogi koncentracija visiems vaistams, o ne realistiška kiekvieno vaisto didžiausia koncentracija; tik pasirinktos poros su azitromicinu arba rifampinu; viena padermė; jokių gyvūnų ir jokių pacientų. Vėlesni tyrimai su trimis vaistais buvo pasiūlyti, bet jų rezultatų nepateikta.

Tyrimų sandaros palyginimas

Lentelėje glaustai pateikta šio straipsnio esmė. Viskas, kas yra kairiau paskutinio stulpelio, susiję su kultūrų tyrimais. Nė viename straipsnyje nėra duomenų, kurie patektų į paskutinį stulpelį.

Bartonella nėra Borrelia

Abiejuose straipsniuose minima Borrelia burgdorferi, Laimo ligą sukelianti spirocheta, nes dažais pagrįstas tyrimo metodas kilo iš ankstesnių tos pačios laboratorijos darbų su stacionariosios fazės Borrelia. Juose metileno mėlynasis ir daptomicinas taip pat buvo nustatyti kaip aktyvūs junginiai. Ši istorija suteikia naudingo konteksto, tačiau kartu dažnai tampa klaidų šaltiniu.

Nė viename šių Bartonella straipsnių eksperimente Borrelia ir Bartonella netiriamos greta. Skiriasi organizmai, terpės ir koncentracijos, o numanomas metileno mėlynojo poveikis Bartonella membranai buvo pateiktas kaip prielaida, kurią reikia toliau tirti. Rezultatų negalima perkelti iš vienos rūšies kitai, ir nė vienas straipsnis nepagrindžia plačių teiginių apie parazitus. Būtent dėl šios priežasties Borrelia ir Bartonella persistuojančių ląstelių palyginime šios dvi mokslinės literatūros sritys atskiriamos.

Kodėl kultūrų rezultatai nevirsta gydymo protokolu

Susidomėjimas metileno mėlynojo taikymo nuo Bartonella protokolo paieškomis suprantamas. Tačiau būtent šie straipsniai parodo, kodėl tokią frazę reikėtų vertinti kaip įspėjamąjį ženklą, o ne pirkinių sąrašą.

Pirma, 5 mikrogramai viename mL šulinėlyje nėra vaisto paskyrimas. Šis skaičius neapima absorbcijos, pasiskirstymo, jungimosi su baltymais, prasiskverbimo į ląsteles ar toleravimo. Autoriai jį pasirinko kaip apytikrį didžiausių antibiotikų koncentracijų vidurkį ir nurodė, kad būsimuose tyrimuose kiekvieną vaistą reikėtų tirti jam būdinga realistiška koncentracija.

Antra, nulis kolonijų reiškia, kad kolonijų nėra tomis pasėjimo sąlygomis, o ne kad audinys sterilus. Persistuojančios ląstelės, ląstelių viduje esančios bakterijos ir mėginių ėmimo ribotumai nepatenka į agaro lėkštelės modelį.

Trečia, deriniai, kurie sterilizuoja šulinėlį, organizme gali neveikti arba pakenkti. Azitromicinas su metileno mėlynuoju ir rifampinas su metileno mėlynuoju yra laboratorinės poros, tirtos laboratorinėmis poveikio koncentracijomis. Neturint farmakokinetikos duomenų iš tyrimų su gyvūnais ir kontroliuojamų tyrimų su žmonėmis duomenų, nenustatyta nei dozė, nei trukmė, nei naudos ir rizikos santykis. Kiekvienas, svarstantis galimybes, turėtų aptarti jas su gydytoju ir, prieš darydamas bet kokias išvadas iš lėkštelių duomenų, susipažinti su informacija apie tai, kada vartojant metileno mėlynąjį būtina medicininė priežiūra.

Siaura išvada, kurią šie straipsniai iš tiesų pagrindžia, yra tokia: metileno mėlynasis pasižymi pakartojamu aktyvumu prieš nesidauginančias B. henselae JK53 in vitro, taip pat laboratoriniuose dviejų vaistų deriniuose. Ryškiausi derinių ir iš bioplėvelės išskirtų ląstelių rezultatai gauti 2020 m. tyrime. Visa kita, įskaitant tai, ar šis aktyvumas reikšmingas žmonių bartoneliozei, lieka neištirta.