Metileno mėlis ir ATP: ar daugiau deguonies reiškia daugiau energijos?

Izoliuota mitochondrija yra kameroje, kurioje yra energinio substrato, bet nėra ADP. Ji lėtai vartoja deguonį. Pridėjus ADP, deguonies suvartojimas padidėja kelis kartus. Palaukus, kol ADP išsenka, deguonies suvartojimas vėl sumažėja. Energinis substratas nepasikeitė. Pasikeitė tik ATP poreikis.

Ši trumpa seka atskleidžia esminį skirtumą, apie kurį kalbama šiame straipsnyje. Deguonies suvartojimas rodo, kaip greitai elektronai kvėpavimo grandine teka į deguonį. ATP gamyba rodo, kiek šio srauto energijos sukaupiama panaudojama forma. Abu procesus sieja tarpinis etapas – protonų gradientas abipus vidinės mitochondrijų membranos. Viskas, kas keičia šio gradiento susiejimo su ATP sinteze glaudumą, gali šiuos du galutinius rodiklius keisti skirtingomis kryptimis. Metileno mėlis čia yra naudingas pavyzdys, nes tyrimuose nustatyti abu jo poveikio variantai: kai kuriuose preparatuose kartu didėjo deguonies suvartojimas ir ATP gamyba, o kituose deguonies suvartojimas didėjo, nors ATP gamyba nekito arba mažėjo.

Skaitytojai, norintys pirmiausia susidaryti platesnį elektronų pernašos vaizdą, gali pradėti nuo paaiškinimo, kaip metileno mėlis perneša elektronus kvėpavimo grandinėje, o norintys susipažinti su ankstyvųjų deguonies eksperimentų terminija gali paskaityti, ką iš tikrųjų parodė pirmieji kvėpavimo matavimai.

Kvėpavimas, ATP ir juos siejantis gradientas

Elektronai iš NADH ir FADH2 patenka į grandinę per I ir II kompleksus, per III kompleksą pasiekia citochromą c, o tada per IV kompleksą – deguonį. I, III ir IV kompleksuose išsiskirianti energija naudojama protonams pumpuoti iš matricos į tarpmembraninę erdvę. Taip susidaręs krūvio ir rūgštingumo skirtumas yra protonų varomoji jėga, o jos elektrinė dalis – membranos potencialas – paprastai sudaro didžiąją jos dalį.

ATP sintazė leidžia protonams tekėti atgal į matricą ir naudoja išsiskiriančią energiją ADP ir fosfatui sujungti į ATP. Taigi seka yra tokia:

deguonies suvartojimas, tada protonų pumpavimas, tada gradientas, tada ATP sintezė.

Tačiau protonai gali grįžti ir kitais keliais. Bet koks jų grįžimas aplenkiant ATP sintazę yra protonų nuotėkis. Dėl nuotėkio grandinė turi vėl pumpuoti tuos pačius protonus, kad išlaikytų pastovų membranos potencialą. Tam suvartojama daugiau deguonies, bet daugiau ATP nesusidaro. Pakankamai stiprus nuotėkis atsieja kvėpavimą nuo ATP sintezės: deguonies suvartojimas didėja, nors ATP gamyba nekinta arba mažėja, o nepanaudota energija išsiskiria kaip šiluma.

3 būsena, 4 būsena ir kvėpavimo kontrolės koeficientas

Klasikinė šių procesų terminija kilo iš izoliuotų mitochondrijų tyrimų. 3 būsena – tai kvėpavimas, kai yra substrato ir ADP: ATP sintazė mažina gradientą, membranos potencialas krinta, grandinė spartėja, kad jį atkurtų, o deguonies suvartojimas yra didelis, nes gaminamas ATP. 4 būsena – tai kvėpavimas išsekus ADP: ATP sintazė beveik neveikia, gradientas didėja, aukštas membranos potencialas apsunkina tolesnį pumpavimą, o deguonies suvartojimas sumažėja iki lygio, reikalingo nuotėkiui kompensuoti.

Todėl kvėpavimo kontrolės koeficientas, apskaičiuojamas 3 būsenos kvėpavimo greitį padalijus iš 4 būsenos kvėpavimo greičio, parodo, kaip glaudžiai preparate susieti kvėpavimas ir ATP sintezė. Didelis koeficientas reiškia, kad ADP stipriai kontroliuoja kvėpavimą. Mažėjantis koeficientas kartu su didėjančiu 4 būsenos kvėpavimu reiškia, kad ima vyrauti nuotėkis. Šis požiūris padeda suprasti toliau aptariamus metileno mėlio tyrimų rezultatus.

Verta įsidėmėti vieną principą. Aukštas membranos potencialas lėtina grandinę. Potencialo išsklaidymas ją spartina. Grandinė reaguoja į tai, kiek sunku pumpuoti protonus, o ne tiesiogiai į tai, ar gaminamas ATP.

Kai galutiniai rodikliai kinta kartu

Aiškiausias susietų procesų pavyzdys gautas tiriant izoliuotas jūrų kiaulyčių smegenų mitochondrijas su užblokuotais kvėpavimo grandinės kompleksais. Esant metileno mėlio koncentracijai nuo 100 nanomolių litre iki 1 mikromolio litre, ramybės būsenos deguonies suvartojimas didėjo, kai energinis substratas buvo glutamatas su malatu, sukcinatas arba glicerofosfatas, tačiau ADP stimuliuojamas kvėpavimas nekito. Mitochondrijose, kurių I arba III kompleksas buvo slopinamas nuodais, dažiklis šiek tiek padidino ATP gamybą, atkūrė membranos potencialą ir pagerino kalcio įsisavinimą. Siūlomas mechanizmas – trumpesnis kelias: dažiklis priima elektronus prieš užblokuotą grandinės vietą ir perduoda juos citochromui c, aplenkdamas pažeistą kompleksą.

Antruoju susietų pokyčių atveju ATP šaltinis buvo visiškai kitoks. Izoliuotose smegenų mitochondrijose su slopinama ATP sintaze metileno mėlis vis tiek skatino kvėpavimą su kiekvienu tirtu substratu. Tačiau ATP sintezė didėjo tik naudojant alfa ketoglutaratą ir glutamatą – du substratus, iš kurių susidaro sukcinil-KoA. Oligomicinui blokuojant ATP sintazę, papildomas ATP susidarė dėl substratinio fosforilinimo, kurį citrinų rūgšties cikle katalizavo sukcinil-KoA ligazė, o ne dėl oksidacinio fosforilinimo. Dažiklis taip pat atkūrė membranos potencialą, kai kartu buvo slopinami I kompleksas ir ATP sintazė. Šiuo atveju deguonies suvartojimas ir ATP gamyba didėjo kartu, bet tik tada, kai substratas leido veikti antrajam ATP gamybos keliui. Naudojant sukcinatą arba malatą, kvėpavimas stiprėjo, bet papildomo ATP nesusidarydavo. Tas pats dažiklis, ta pati kamera, kitas energinis substratas – kitas rezultatas.

Kai galutinių rodiklių pokyčiai išsiskiria

Atvejai, kai šių rodiklių pokyčiai išsiskiria, taip pat aprašyti paskelbtuose tyrimuose ir yra ne mažiau pamokantys. 1997 m. izoliuotų žiurkių kepenų mitochondrijų tyrime metileno mėlis spartino 4 būsenos kvėpavimą mitochondrijose, naudojančiose sukcinatą ir pasižyminčiose glaudžiu kvėpavimo bei ATP sintezės susiejimu. Dėl to kvėpavimo kontrolės koeficientas mažėjo. Poveikis buvo matomas nuo 0.5 mikromolio litre ir ryškus esant 5 mikromolių litre koncentracijai, artimai koncentracijai plazmoje po 100 miligramų boliuso į veną. Esant 5 mikromolių litre koncentracijai, mitochondrijos taip pat išbrinko, tačiau susiejimo sutrikimas pirmiausia pasireiškė esant mažesnėms koncentracijoms. Tai leidžia manyti, kad nuotėkis atsirado prieš struktūrinį pažeidimą, o ne dėl jo. Mitochondrijose, kurių kvėpavimas buvo atsietas nuo ATP sintezės, dažiklis skatino kvėpavimą nuo koncentracijos priklausančiu būdu, o šis poveikis pasiekdavo prisotinimą. Deguonies suvartojimas didėjo abiejuose preparatuose. ATP sintezė, tenkanti suvartoto deguonies kiekiui, nedidėjo. Tai klasikinis atsiejimo ir elektronų pernašos derinys vienoje molekulėje.

Ryškiausias išsiskyrimo pavyzdys nustatytas tinklainėje. Pelėse, kurioms trūko AIF, ir rotenonu paveiktose fotoreceptorių ląstelėse metileno mėlis išsaugojo tinklainės storį, fotoreceptorių žymenis ir mitochondrijų struktūrą, sumažino NADH ir NAD santykį bei slopino streso signalinius kelius, įskaitant atsaką į nesusilanksčiusius baltymus ir mitofagiją. Visa tai vyko nepašalinus ATP trūkumo. Apsauga neatkūrus energijos gamybos reiškia, kad nauda buvo susijusi su redokso pusiausvyra ir mitochondrijų vientisumu, o ne su papildomu ATP. Audinio išlikimą prilyginus atkurtai energijos gamybai, šis eksperimentas būtų suprastas visiškai klaidingai.

Smegenų mitochondrijų tyrimai prie šių rezultatų prideda ir neigiamą aspektą. Tos pačios mažos koncentracijos, kurios pagerino bioenergetiką, visomis tirtomis sąlygomis taip pat didino vandenilio peroksido susidarymą ir lėtino jo pašalinimą. Tai matuota kalibruotu Amplex tyrimu, o ne nespecifiniu dažikliu. Daugiau ATP ir daugiau oksidanto atsirado kartu.

Praktinis rezultatų vertinimo klausimynas

Keturi klausimai padeda atskirti susietą rezultatą nuo atsieto.

Pirma, kuris galutinis rodiklis iš tikrųjų buvo matuotas. Vien deguonies suvartojimas negali parodyti ATP gamybos. ATP sintezė, membranos potencialas ir kvėpavimo kontrolės koeficientas suteikia po papildomą informacijos dalį, kurios deguonies elektrodas neparodo. Metileno mėlio tyrimų teiginių vertinimo vadove išsamiai aptariama, kaip nuosekliai atsižvelgti į šiuos galutinius rodiklius.

Antra, koks substratas buvo tiekiamas mitochondrijoms. Sukcinil-KoA rezultatas rodo, kad energinio substrato pasirinkimas gali lemti, ar sustiprėjęs kvėpavimas apskritai gali virsti papildomu ATP.

Trečia, kokia koncentracija buvo naudota. Nuo nanomolinės iki mažos mikromolinės metileno mėlio koncentracijos smegenų mitochondrijose suteikė nedidelį bioenergetinį pagerėjimą, bet kartu didino oksidantų kiekį; pusės mikromolio litre ir didesnės koncentracijos kepenų mitochondrijose silpnino susiejimą; esant 5 mikromoliams litre, prisidėjo ir brinkimas. Koncentracija yra mechanizmo dalis, o ne antraeilė detalė.

Ketvirta, kokiame modelyje gautas rezultatas. Izoliuotos mitochondrijos atskleidžia mechanizmų sandarą, tačiau nepažeistose ląstelėse ir audiniuose papildomai veikia pernaša, redukcija į bespalvę formą ir konkuruojantys elektronų akceptoriai. Laboratoriniai dozavimo tyrimai, įskaitant tai, kaip koncentracija ir protokolas lemia metileno mėlio poveikį, yra jungtis tarp kameroje išmatuotų skaičių ir bet kokio teiginio apie žmogų.

Deguonies suvartojimas rodo elektronų srautą. ATP rodo, kiek šio srauto energijos buvo sukaupta. Metileno mėlis gali keisti bet kurį iš šių rodiklių, o pirmiau aptarti eksperimentai parodo visus keturis variantus: abu rodikliai didėja, kvėpavimas stiprėja tik ten, kur tai leidžia substratas, kvėpavimas stiprėja, nors susiejimas silpnėja, ir audinys išsaugomas, nors ATP gamyba nekinta. Deguonies elektrodo rodmuo yra interpretacijos pradžia, o ne jos pabaiga.