EMB agaras ir MacConkey agaras: terpių parinkimas ir interpretavimas

Studentas tuo pačiu vandens mėginiu užsėja dvi lėkšteles. Vienoje atsiranda tamsios kolonijos su žaliu metaliniu žvilgesiu. Kitoje – ryškiai rausvos kolonijos su drumstu halu. Abi lėkštelės buvo pasėtos iš to paties mėgintuvėlio, inkubuotos greta ir įvertintos tuo pačiu metu. Studentas klausia, kuri lėkštelė yra teisinga.

Teisingos abi lėkštelės. Jos atsako į skirtingus klausimus. Painiava kyla, kai šios dvi terpės laikomos tarpusavyje pakeičiamomis žarnyno bakterijų atrankos terpėmis. Jų paskirtis panaši – atrinkti gramneigiamus enterinius mikroorganizmus ir atskirti laktozę fermentuojančius mikroorganizmus nuo jos nefermentuojančių, tačiau šią paskirtį jos įgyvendina naudodamos skirtingą chemiją ir skirtingą vizualinę logiką. Supratus šias dvi pagrindines koncepcijas, terpės pasirinkimas ir kolonijų vertinimas tampa įprasta procedūra.

Trumpas atsakymas

EMB agare naudojami du dažikliai – eozinas Y ir metileno mėlis – atliekantys dvi funkcijas: jie slopina gramteigiamų mikroorganizmų augimą ir nusėda aplink stipriai rūgštį gaminančias kolonijas, todėl susidaro tamsios kolonijos, o Escherichia coli atveju klasikinis požymis yra metalinis žalias žvilgesys. MacConkey agare šios funkcijos atskirtos: tulžies druskos kartu su kristaliniu violetu slopina gramteigiamus mikroorganizmus, laktozė yra fermentacijos substratas, o neutralusis raudonasis parodo rūgšties susidarymą rausva arba raudona kolonijų spalva. Jei užduotis – ryškiai pademonstruoti numanomą E. coli, EMB turi aiškią paskirtį. Jei reikia aiškiai atskirti rausvus laktozės fermentuotojus nuo bespalvių nefermentuotojų, ypač išmatų ar šlapimo tyrimų procesuose, MacConkey paprastai yra lengviau interpretuoti. Vien kolonijos spalva nė vienoje terpėje neleidžia identifikuoti mikroorganizmo.

EMB: dažikliai, kurie vienu metu atrenka ir parodo reakciją

EMB koncepcijoje atranka ir indikacija sutelktos tose pačiose molekulėse. ASM eozino ir metileno mėlio agaro protokole EMB apibūdinamas kaip selektyvioji ir diferencinė terpė, kurioje dažiklių pora slopina daugelį gramteigiamų mikroorganizmų, o laktozės fermentacija skatina dažiklių pasisavinimą ir nusėdimą. Standartinėje Levine formulėje yra peptono, laktozės, fosfato, eozino Y, metileno mėlio ir agaro, kaip nurodyta FDA BAM Levine EMB agaro metode. Atkreipkite dėmesį, kad kai kuriuose senesniuose EMB receptuose kartu su laktoze buvo dedama sacharozės, o Levine EMB sudėtyje yra laktozės be sacharozės, todėl užrašykite, kokią formulę naudoja jūsų laboratorija.

Vertinant EMB reikia stebėti dažiklių elgseną. Intensyvi laktozės fermentacija pagamina pakankamai rūgšties, kad sukeltų gausų dažiklių nusėdimą, todėl E. coli kolonijų centrai tampa tamsiai mėlynai juodi, o klasikiniu atveju atspindėtoje šviesoje matomas metalinis žalias žvilgesys. Silpnesni fermentuotojai, tokie kaip Enterobacter ir Klebsiella, paprastai auga kaip rausvos arba violetinės gleivingos kolonijos be šio žvilgesio. Nefermentuotojai, tokie kaip Salmonella, Shigella ir Proteus, paprastai sudaro bespalves arba permatomas kolonijas, nes nesukelia staigaus rūgšties padidėjimo, dėl kurio nusėda dažikliai. Gramteigiami mikroorganizmai paprastai slopinami, nors slopinimo laipsnis priklauso nuo padermės ir produkto. Išsami dažiklių paruošimo chemija, įskaitant priežastį, kodėl metileno mėlis pirmiausia veikia kaip katijoninis dažiklis, priklauso atskirai diskusijai apie dažiklių formules, o bendras mikroskopijos kontekstas pateiktas dažymo metodų atlase. Šiame straipsnyje apsiribojama terpių pasirinkimu ir jų vertinimu.

Aukščiau pateiktas paveikslas yra iliustracinis. Jis parodo numatomą vizualinę logiką: EMB terpėje matomos tamsios žvilgančios kolonijos, rausvos gleivingos kolonijos ir blyškios kolonijos, o MacConkey terpėje – rausvos ir blyškios kolonijos. Naudokite jį modeliui išmokti, tada kiekvieną interpretaciją patvirtinkite pagal nufotografuotas kontrolines kultūras ir konkrečios jūsų darbo vietoje naudojamos terpės produkto instrukciją.

MacConkey: atskiros funkcijos, paprastesnė vizualinė taisyklė

MacConkey koncepcijoje kiekviena funkcija priskiriama atskiram komponentui. ASM MacConkey agaro protokole pateikiama ta pati selektyviosios ir diferencinės terpės samprata, o FDA BAM MacConkey agaro metode išvardyti pagrindiniai komponentai: peptonai, laktozė, tulžies druskos, druska, neutralusis raudonasis, kristalinis violetas ir agaras. Tulžies druskos kartu su kristaliniu violetu slopina gramteigiamus mikroorganizmus. Laktozė yra fermentacijos substratas. Neutralusis raudonasis veikia kaip pH indikatorius ir ten, kur susidaro rūgštis, tampa rausvas arba raudonas; aplink stiprius fermentuotojus kartais taip pat nusėda tulžies komponentai.

Vertinimo taisyklė sąmoningai paprasta: rausva spalva reiškia laktozės fermentuotoją, o bespalvė arba blyški – nefermentuotoją. E. coli atrodo rausva arba raudona, dažnai su tulžies nuosėdų halu. Klebsiella ir Enterobacter kolonijos būna rausvos ir dėl kapsulių dažnai gleivingos. Salmonella, Shigella, Proteus ir daugelis kitų gramneigiamų lazdelių atrodo bespalvės. Mokomosiose laboratorijose svarbus ir papildomas privalumas: tulžies druskos paprastai sumažina Proteus plitimą, todėl MacConkey terpėje lengviau gauti izoliuotas kolonijas nei neselektyviose terpėse, nors slopinimas nėra absoliutus, o kai svarbiausia kontroliuoti plitimą, galima naudoti alternatyvas be druskos.

Molekulinė priežastis, dėl kurios dažikliai taip elgiasi, susijusi su jų krūviu ir struktūra. Metileno mėlis yra katijoninis fenotiazino dažiklis, kurio struktūra ir savybės paaiškina jo afinitetą rūgštiems bakterijų paviršiams; tas pats afinitetas pasireiškia ir jam nusėdant rūgščiose EMB terpės zonose.

Palyginimas trumpai

Lentelę vertinkite kaip sprendimo priėmimo schemą. Kai mokymo užduotyje studentams reikia pamatyti skirtingą fermentacijos intensyvumą ir vieną ryškų kraštutinį rezultatą, tai gerai parodo EMB. Kai prieš biocheminį patvirtinimą reikia greitai binariai atskirti fermentuotojus nuo nefermentuotojų, tai aiškiau parodo MacConkey.

Kuri terpė kuriam mėginiui

Vandens tyrimų pratybose, skirtose numanomiems fekaliniams koliformams arba E. coli atpažinti, EMB yra patraukli dėl vizualiai išskirtinio žvilgesio. MacConkey taip pat tinka enteriniams gramneigiamiems mikroorganizmams ir istoriškai buvo naudojama vandens tyrimams, tačiau nė viena iš šių terpių nepakeičia reglamentuoto vandens tyrimo metodo, kuriame, priklausomai nuo tyrimo, gali būti nurodytos tokios terpės kaip modifikuota mTEC arba MI. Vadovaukitės metodu, kurio privalo laikytis jūsų laboratorija.

Atliekant išmatų mėginių tipo fermentuotojų ir nefermentuotojų atskyrimą, MacConkey iš šių dviejų terpių paprastai yra naudingesnė. Praktiniuose išmatų tyrimuose dėl Salmonella arba Shigella paprastai papildomai naudojamos selektyvesnės enterinės terpės, tokios kaip XLD arba Hektoen enterinė terpė, užuot pasikliaujant vien MacConkey.

Mokant šlapimo mėginių tyrimo pagal klinikinio darbo modelį, MacConkey derinkite su kraujo agaru. MacConkey leidžia anksti atskirti gramneigiamus mikroorganizmus, o kraujo agaras leidžia išauginti mikroorganizmus, kuriuos MacConkey slopina. Toks derinys įprastai aprašomas klinikinėse šlapimo pasėlio atlikimo schemose.

Mokant vien pačios koncepcijos, naudokite abi terpes. EMB parodo, kad fermentacijos intensyvumas yra svarbus ir kad viena molekulė gali atlikti dvi funkcijas. MacConkey moko modulinio dizaino: atrankos komponentas, substratas ir indikatorius yra atskirti. Studentai, kurie abiejose terpėse greta pasėja žinomą E. coli, žinomą Klebsiella aerogenes ir žinomą Salmonella, vėliau retai painioja šias dvi logikas.

Interpretavimo klaidos, pasikartojančios kiekvieną semestrą

Dažniausia klaida – identifikavimas vien pagal spalvą. Rausva kolonija MacConkey terpėje gali būti E. coli, Klebsiella, Enterobacter ar kitas fermentuotojas. Bespalvė kolonija gali būti Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ar kitas nefermentuotojas. Spalva yra atrankinis fenotipas, nurodantis tolesnių patvirtinamųjų tyrimų kryptį, pavyzdžiui, dažymą Gramo būdu, oksidazės testą, biocheminių tyrimų paneles arba instrumentinį identifikavimą, o ne rūšies pavadinimas.

Antroji klaida – pernelyg sureikšminti žvilgesio nebuvimą. Kai kurios tikros E. coli kolonijos, ypač izoliuotos, EMB terpėje sukuria labai silpną metalinį žvilgesį arba jo visai nesukuria. Žvilgesio nebuvimas neatmeta E. coli, o jo buvimas jos neįrodo. Žvilgesį vertinkite kaip numanomą požymį.

Trečioji klaida – lyginti skirtingo amžiaus lėkšteles. Vėlyvieji laktozės fermentuotojai po ilgesnės inkubacijos MacConkey terpėje gali tapti rausvi, todėl aiški riba tarp fermentuotojų ir nefermentuotojų išnyksta. Vertinkite laboratorijos nustatytu laiku ir kartu su rezultatu registruokite inkubacijos trukmę.

Ketvirtoji klaida – mišrų augimą interpretuoti kaip vieną mikroorganizmą. Rausva kolonija šalia bespalvės kolonijos reiškia du fenotipus, o ne tarpinį variantą. Atrinkite gerai izoliuotas kolonijas ir kiekvieną morfotipą tirkite atskirai. Gleivinga tekstūra sukelia panašią problemą: tiek Klebsiella, tiek Enterobacter gali atrodyti gleivingos, todėl vien kapsulė niekada nenustato pavadinimo. Mikroorganizmas, kuris anksčiau buvo mokomas kaip Enterobacter aerogenes, dabar klasifikuojamas kaip Klebsiella aerogenes, todėl senesnės lentelės gali nesutapti su naujesniais pavadinimais.

Kontrolės ir baigiamoji taisyklė

Kiekvieno darbo metu naudokite nufotografuotas arba šviežias kontrolines kultūras: E. coli stipriai fermentacijos reakcijai, Klebsiella aerogenes gleivingai fermentacijai be klasikinio žvilgesio, Salmonella padermę bespalvei nefermentuotojo reakcijai ir Staphylococcus aureus, kad patvirtintumėte gramteigiamų mikroorganizmų slopinimą konkrečiame naudojamame produkte. Padermių numerius ir priėmimo kriterijus derinkite su gamintojo instrukcija, nes selektyvumas kinta priklausomai nuo tulžies, kristalinio violeto ir dažiklių kiekio.

Prie darbo stalo prisiminkite vieną sakinį. EMB naudoja dažiklius, kurie ir atrenka, ir parodo reakciją, todėl gaunamas ryškus E. coli signalas, tačiau interpretavimas yra subtilesnis. MacConkey atskiria atranką nuo reakcijos parodymo, todėl suteikia paprastą rausvų ir blyškių kolonijų atskyrimą, tačiau pateikia mažiau informacijos apie fermentacijos intensyvumą. Pasirinkite terpę, kurios koncepcija atitinka klausimą, spalvą patvirtinkite tinkamais tyrimais, ir šios dvi lėkštelės nebekonkuruos, o papildys viena kitą.