ເມທິລີນບລູສຳລັບຍ້ອມສີ DNA ແລະ RNA: ການນຳໃຊ້ກັບເຈວ ແລະແຜ່ນເມມເບຣນ

ນັກສຶກສາຄົນໜຶ່ງແຍກຕົວຢ່າງດ້ວຍເຈວອາກາໂຣສ, ຍ້ອມສີດ້ວຍເມທິລີນບລູ ແລະບໍ່ເຫັນຫຍັງໃນຈຸດທີ່ຄາດວ່າຈະມີແຖບສີຊັດເຈນ. ຢູ່ໂຕະທົດລອງຂ້າງໆ, ນັກວິຈັຍຫຼັງປະລິນຍາເອກຍ້ອມສີແຜ່ນເມມເບຣນ Northern ດ້ວຍສີຟ້າຈາກຂວດດຽວກັນ ແລະໄດ້ແຖບ RNA ໄຣໂບໂຊມທີ່ຄົມຊັດໃນສາມນາທີ. ນັກສຶກສາຈຶ່ງສະຫຼຸບວ່າການແຍກດ້ວຍເຈວລົ້ມເຫຼວ. ແຕ່ເຈວບໍ່ໄດ້ລົ້ມເຫຼວ. ວຽກສອງຢ່າງນີ້ແຕກຕ່າງກັນ ແລະສີຍ້ອມດຽວກັນໃຫ້ຄຳຕອບດ້ວຍຄວາມໄວໃນການກວດພົບ, ສີພື້ນຫຼັງ ແລະຫຼັກເກນສຳລັບຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປທີ່ຕ່າງກັນ.

ການຍ້ອມສີ DNA ແລະການຍ້ອມສີ RNA ດ້ວຍເມທິລີນບລູໃຊ້ເຄມີແບບດຽວກັນ ແຕ່ຈຸດປະສົງບໍ່ຄືກັນ. ໃນເຈວ, ສີຍ້ອມບອກວ່າມີກົດນິວຄລີອິກຫຼາຍປານໃດຢູ່ໃນໂຄງຮ່າງທີ່ມີຮູພຸນ. ເທິງແຜ່ນເມມເບຣນ, ມັນບອກວ່າການຖ່າຍໂອນສຳເລັດຫຼືບໍ່ ແລະໃສ່ຕົວຢ່າງໃນແຕ່ລະຊ່ອງເທົ່າກັນຫຼືບໍ່. ເມື່ອເຂົ້າໃຈຄວາມແຕກຕ່າງນີ້ແລ້ວ, ວິທີປະຕິບັດ, ຂີດຈຳກັດການກວດພົບ ແລະຂໍ້ຈຳກັດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ກໍຈະເຂົ້າໃຈງ່າຍຂຶ້ນ.

ຄຳຕອບແບບສັ້ນ

ເມທິລີນບລູເປັນສີຍ້ອມທີ່ມີໂຄງສ້າງແບນ ແລະມີປະຈຸບວກ. ມັນຈັບກັບກົດນິວຄລີອິກແບບບໍ່ເກີດພັນທະໂຄເວເລນ ແລະປີ້ນກັບໄດ້, ຜ່ານການປະສົມກັນຂອງແຮງດຶງດູດໄຟຟ້າສະຖິດກັບຟອສເຟດ, ການແຊກລະຫວ່າງຄູ່ເບສ ແລະການຈັບກັບຮ່ອງນ້ອຍ. ຄວາມສາມາດໃນການປີ້ນກັບນີ້ແມ່ນຈຸດສຳຄັນ. ສາມາດຍ້ອມສີແຖບ, ເບິ່ງດ້ວຍແສງທີ່ເບິ່ງເຫັນ, ບັນທຶກຜົນ ແລ້ວລ້າງສີອອກ ຫຼືທຳຄວາມສະອາດຕົວຢ່າງເພື່ອໂຄລນ, ປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ ຫຼືກວດດ້ວຍໂພຣບອີກຄັ້ງ.

ສຳລັບການຍ້ອມສີ DNA ສາຍຄູ່ໃນເຈວອາກາໂຣສດ້ວຍເມທິລີນບລູ, ສູດມາດຕະຖານແບບໄວແມ່ນ 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ໃນນ້ຳ, ຍ້ອມສີປະມານ 15 minutes ແລະລ້າງສີດ້ວຍນ້ຳອີກປະມານ 15 minutes, ແລ້ວເບິ່ງເທິງກ່ອງແສງຂາວ. ສຳລັບແຜ່ນເມມເບຣນ, ສູດ Northern blot ແບບດັ້ງເດີມໃຊ້ສີຍ້ອມ 0.02 ຫາ 0.04 percent ໃນໂຊດຽມອາເຊເຕດທີ່ pH ໃກ້ 5.2, ຍ້ອມສີສອງສາມນາທີຫຼັງຈາກຖ່າຍໂອນ ແລະຕຶງຕົວຢ່າງ, ແລ້ວລ້າງດ້ວຍນ້ຳ ແລະລ້າງສີອອກໃຫ້ໝົດກ່ອນການປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ. ຄວາມໄວໃນການກວດພົບບໍ່ສູງ: ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ດີຈະຢູ່ທີ່ຫຼາຍສິບຫາຫຼາຍຮ້ອຍ nanograms ຕໍ່ແຖບໃນເຈວ, ແລະຄູ່ມືທີ່ໃຊ້ຄ່າແບບລະມັດລະວັງລະບຸ 0.5 ຫາ 1 microgram. ປະລິມານນີ້ສູງກວ່າຂີດຈຳກັດການກວດພົບຂອງເອທິດຽມໂບຣມາຍ ແລະສີ SYBR ຫຼາຍລຳດັບຂັ້ນ. ເທິງແຜ່ນເມມເບຣນບໍ່ມີຄ່າຂີດຈຳກັດການກວດພົບທຣານສະຄຣິບຊະນິດດຽວທີ່ໃຊ້ໄດ້ທົ່ວໄປ, ເພາະສີຍ້ອມສ່ວນໃຫຍ່ສະແດງ RNA ໄຣໂບໂຊມທີ່ມີຫຼາຍ ແລະປະລິມານຕົວຢ່າງທັງໝົດທີ່ໃສ່. ຢ່ານຳສານລະລາຍອາຫານເສີມທີ່ຂາຍປີກມາແທນໃນສູດໃດສູດໜຶ່ງ. ວິທີທີ່ຜ່ານການຢືນຢັນຖືກຳນົດໃຫ້ໃຊ້ສີຍ້ອມລະດັບວິເຄາະ, ບັຟເຟີທີ່ມີສ່ວນປະກອບຊັດເຈນ ແລະການຈັດການທີ່ປອດ RNase ເມື່ອມີ RNA ກ່ຽວຂ້ອງ.

ການຈັບເກີດຂຶ້ນແນວໃດ ແລະຈຸດໃດອາດນຳໃຫ້ເຂົ້າໃຈຜິດ

ແບບຈຳລອງທີ່ເປັນປະໂຫຍດມີສາມສ່ວນ. ທຳອິດ, ລະບົບວົງແຫວນທີ່ມີປະຈຸບວກຖືກດຶງດູດເຂົ້າຫາໂຄງຫຼັກຟອສເຟດທີ່ມີປະຈຸລົບ. ການສຶກສາດ້ວຍສະເປັກໂຕຣສະໂຄປີພົບວ່າອົງປະກອບໄຟຟ້າສະຖິດນີ້ເປັນປັດໄຈຫຼັກເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເກືອຕ່ຳ, ຂະນະທີ່ການສ້າງແບບຈຳລອງ ແລະພົນລະສາດໂມເລກຸນຍັງສະແດງວ່າການແຊກລະຫວ່າງຄູ່ເບສ ແລະການຈັບຮ່ອງນ້ອຍເປັນຮູບແບບທີ່ສະຖຽນສຳລັບ DNA ສາຍຄູ່, ດັ່ງທີ່ສະຫຼຸບໃນການສຶກສາການຈັບຂອງເມທິລີນບລູກັບ DNA ດ້ວຍສະເປັກໂຕຣສະໂຄປີ. ທີສອງ, ມັນມີແນວໂນ້ມຈັບກັບ GC ຫຼາຍກວ່າບາງສ່ວນ. ແບບຈຳລອງຊີ້ວ່າມັນຈັບບໍລິເວນ CpG ແລະ GpC ໄດ້ດີກວ່າ, ແລະການທົດລອງລາຍງານວ່າມັນຈັບກັບສາຍຄູ່ທີ່ມີ GC ສູງຫຼາຍກວ່າ ໃນງານສຶກສາຄວາມມັກໃນການແຊກລະຫວ່າງຄູ່ເບສຂອງເມທິລີນບລູ, ແຕ່ສາຍຄູ່ AT ກໍຈັບໄດ້ເຊັ່ນກັນ. ການຍ້ອມສີທົ່ວໄປບໍ່ຈຳເພາະຕໍ່ລຳດັບເບສ. ທີສາມ, DNA ສາຍດ່ຽວ ແລະ RNA ຈັບກັບສີຍ້ອມເປັນຫຼັກຜ່ານແຮງໄຟຟ້າສະຖິດ ແລະການຊ້ອນກັບເບສທີ່ເຂົ້າເຖິງໄດ້ ແລະບໍລິເວນສາຍຄູ່. ດ້ວຍເຫດນີ້, ຄວາມເຂັ້ມຂອງສີຈຶ່ງແຕກຕ່າງຕາມຄວາມຍາວ, ລຳດັບເບສ ແລະໂຄງສ້າງທຸຕິຍະພູມ.

ມີຜົນຕາມມາສອງປະການ. ເນື່ອງຈາກການຈັບບໍ່ເປັນພັນທະໂຄເວເລນ, ສີຍ້ອມຈຶ່ງຖືກລ້າງອອກໄດ້. ແຖບໃນໂພລີອາຄຣິລາໄມດ໌ຈາງໄວ ຖ້າບໍ່ໄດ້ຕຶງໄວ້ໂດຍສະເພາະ. ມີວິທີດັດແປງສຳລັບຕຶງສີແບບຖາວອນ ເພາະການຍ້ອມສີປົກກະຕິເປັນພຽງຊົ່ວຄາວ, ດັ່ງທີ່ໂຊໂຕ ແລະເດຣເປີອະທິບາຍສຳລັບເຈວ PAGE. ເນື່ອງຈາກສີຍ້ອມເປັນສານໄວແສງ, ການສ່ອງແສງສະຫວ່າງແຮງໃສ່ DNA ທີ່ຍ້ອມສີແລ້ວເປັນເວລາດົນໃນສະພາບທີ່ມີອົກຊີເຈນ ອາດເຮັດໃຫ້ກວານີນເກີດອອກຊິເດຊັນ ແລະໃນທີ່ສຸດເກີດຮອຍຂາດໃນສາຍ DNA. ກົນໄກນີ້ມີລາຍລະອຽດໃນງານສຶກສາການອອກຊິໄດຊ໌ກວານີນທີ່ກະຕຸ້ນດ້ວຍເມທິລີນບລູ. ການເບິ່ງດ້ວຍແສງຂາວໃນເວລາສັ້ນຫຼີກລ້ຽງຄວາມເສຍຫາຍຈາກ UV ທີ່ເປັນທີ່ຮູ້ກັນໃນຂັ້ນຕອນເອທິດຽມໂບຣມາຍແບບດັ້ງເດີມ, ແລະຂໍ້ໄດ້ປຽບນີ້ມີຢູ່ຈິງສຳລັບການເກັບຄືນຕົວຢ່າງເພື່ອນຳໃຊ້ຕໍ່. ແສງທີ່ເບິ່ງເຫັນອ່ອນໂຍນກວ່າ, ແຕ່ບໍ່ໄດ້ປອດອັນຕະລາຍ. ຈຳກັດເວລາສ່ອງແສງໃຫ້ສັ້ນເມື່ອຈະນຳ DNA ໄປໂຄລນ. ສຳລັບເຄມີແສງທີ່ອະທິບາຍຂໍ້ຄວນລະວັງນີ້ໃນພາບລວມ, ເບິ່ງສອງເສັ້ນທາງໃນເຄມີແສງຂອງເມທິລີນບລູ. ສຳລັບຄູ່ຣີດອກຊ໌ ແລະສະຖານະປະຈຸທີ່ອະທິບາຍວ່າເປັນຫຍັງຮູບແບບອອກຊິໄດຊ໌ຈຶ່ງຈັບໄດ້ ແຕ່ຮູບແບບຣີດິວຊ໌ຈັບບໍ່ໄດ້, ເບິ່ງເຄມີຂອງໂຄງສ້າງ ແລະຄຸນສົມບັດເມທິລີນບລູ.

ວຽກທີໜຶ່ງ: ການຍ້ອມສີພາຍໃນເຈວ

ການຍ້ອມສີເຈວຕອບຄຳຖາມດຽວ: ມີກົດນິວຄລີອິກໃນແຖບນີ້ພຽງພໍໃຫ້ເຫັນດ້ວຍຕາຫຼືບໍ່. DNA ສາຍຄູ່ໃນອາກາໂຣສເປັນກໍລະນີທີ່ມີການສຶກສາລາຍລະອຽດດີທີ່ສຸດ. ວິທີຍ້ອມສີເຈວດ້ວຍເມທິລີນບລູດັ້ງເດີມຂອງຟລໍເຣສ ແລະຄະນະ ໄດ້ຢືນຢັນວິທີແບບໄວ 0.02 percent ໃນອາກາໂຣສ 1 percent ແລະສະແດງວ່າສາມາດເກັບຄືນ DNA ແລະໂຄລນຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ສຳເລັດ. ວິທີປະຕິບັດດຽວກັນຂອງຜູ້ຈຳໜ່າຍປາກົດຢູ່ໃນໜ້າຜະລິດຕະພັນເມທິລີນບລູຂອງ IBI Scientific, ເຊິ່ງລະບຸສູດ 0.04 percent ສຳລັບແຜ່ນເມມເບຣນ ແລະວິທີແບບໄວສຳລັບເຈວໄວ້ຄູ່ກັນ.

ຂັ້ນຕອນປະຕິບັດ:

1. ແຍກຕົວຢ່າງດ້ວຍເຈວຕາມປົກກະຕິ. ຍ້ອມສີຫຼັງການແຍກດ້ວຍໄຟຟ້າ, ບໍ່ແມ່ນລະຫວ່າງການແຍກ, ເວັ້ນແຕ່ການຖ່າຍໂອນ ຫຼືຄວາມສາມາດໃນການແຍກແຖບຂອງວິທີດັດແປງນັ້ນໄດ້ຜ່ານການຢືນຢັນແລ້ວ.
2. ແຊ່ໃນເມທິລີນບລູ 0.02 percent w/v ໃນນ້ຳກັ່ນ, ພ້ອມກັບແກວ່ງເບົາໆ, ປະມານ 15 minutes.
3. ລ້າງສີອອກໂດຍປ່ຽນນ້ຳຫຼາຍຄັ້ງ, ລວມປະມານ 15 minutes, ຈົນສີພື້ນຫຼັງຂອງໂຄງຮ່າງເຈວຫຼຸດລົງ ແລະແຖບປາກົດເດັ່ນ.
4. ຖ່າຍຮູບທັນທີເທິງເຄື່ອງສ່ອງແສງຂາວ.

ອາກາໂຣສ ແລະໂພລີອາຄຣິລາໄມດ໌ມີພຶດຕິກຳຕ່າງກັນ. ອາກາໂຣສເກັບສີຍ້ອມໄວ້ໃນໂຄງຮ່າງເຈວ, ດັ່ງນັ້ນການລ້າງສີຈຶ່ງເປັນຂັ້ນຕອນທີ່ຊ້າ. ເຈວໂພລີອາຄຣິລາໄມດ໌ບາງໆຍ້ອມສີໄດ້ໄວ ແຕ່ກໍເສຍສີໄວເຊັ່ນກັນ. ສິ່ງນີ້ຊ່ວຍໃນການຕັດແຖບເພື່ອເກັບຕົວຢ່າງໄປໃຊ້ຕໍ່ ແຕ່ບໍ່ດີຕໍ່ການເກັບບັນທຶກໄລຍະຍາວ. ສາມາດຫາຕຳແໜ່ງໂອລິໂກນິວຄລີໂອໄທດ໌ສັງເຄາະໃນໂພລີອາຄຣິລາໄມດ໌ໄດ້ດ້ວຍສູດ 0.02 percent ດຽວກັນ ພາຍໃນ 20 ຫາ 30 minutes ໂດຍລ້າງນ້ຳຊ້ຳຫຼາຍຄັ້ງ, ຕາມວິທີ PAGE ທີ່ຍອມຮັບກັນໃນຮູບແບບຂອງ Current Protocols. ມີລາຍງານການໃຊ້ສູດທີ່ເຈືອຈາງຫຼາຍ ໃກ້ 0.0002 percent ໃນ TBE ເຈືອຈາງ ສຳລັບໂອລິໂກນິວຄລີໂອໄທດ໌ທີ່ຈະເກັບໄປໃຊ້ຕໍ່ ໂດຍໃຊ້ເວລາຫຼາຍຊົ່ວໂມງ, ແຕ່ຫຼັກຖານສະໜັບສະໜູນຍັງມີໜ້ອຍກວ່າ.

ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງ DNA ແລະ RNA ມີຄວາມສຳຄັນ. DNA ສາຍຄູ່ໃຫ້ການຈັບຕາມໂຄງສ້າງທີ່ແຂງແຮງທີ່ສຸດ. RNA ແລະ DNA ສາຍດ່ຽວຍ້ອມສີໄດ້, ແຕ່ອ່ອນກວ່າ ແລະຄາດຄະເນໄດ້ຍາກກວ່າ. ສຳລັບເຈວອາກາໂຣສທີ່ມີຟໍມາລດີໄຮດ໌ສຳລັບ RNA, ຫ້ອງທົດລອງສ່ວນໃຫຍ່ຂ້າມການຍ້ອມສີຟ້າໃນເຈວ ແລະຖ່າຍໂອນ RNA ໄປແຜ່ນເມມເບຣນກ່ອນ, ແລ້ວຍ້ອມສີຢູ່ທີ່ນັ້ນ. ວິທີນີ້ແລກສັນຍານອ່ອນໃນເຈວກັບສັນຍານທີ່ຄົມຊັດກວ່າເທິງແຜ່ນເມມເບຣນ ພ້ອມທັງໄດ້ບັນທຶກການໃສ່ຕົວຢ່າງ.

ວຽກທີສອງ: ການຍ້ອມສີເທິງແຜ່ນເມມເບຣນ

ການຍ້ອມສີແຜ່ນເມມເບຣນຕອບຄຳຖາມທີ່ຕ່າງອອກໄປ: ການຖ່າຍໂອນສຳເລັດຫຼືບໍ່ ແລະແຕ່ລະຊ່ອງປຽບທຽບກັນໄດ້ຫຼືບໍ່. ການນຳໃຊ້ແບບດັ້ງເດີມແມ່ນການຍ້ອມສີ Northern blot ແບບປີ້ນກັບໄດ້ຂອງເຮີຣິນ ແລະຊະມິດ. ສູດເດີມໃຊ້ສີຍ້ອມ 0.04 percent ໃນໂຊດຽມອາເຊເຕດ 50 mM ທີ່ pH 5.0 ເປັນເວລາ 2 ຫາ 3 minutes ແລ້ວລ້າງດ້ວຍນ້ຳ, ໂດຍສາມາດລ້າງສີອອກດ້ວຍ SDS ເຈືອຈາງໃນ SSPE ກ່ອນການປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ.

ວິທີດັດແປງສະໄໝໃໝ່ທີ່ໃຊ້ກັນຢ່າງແຜ່ຫຼາຍມີຂັ້ນຕອນດັ່ງນີ້:

1. ຖ່າຍໂອນ RNA ຫຼື DNA ທີ່ແຍກສາຍແລ້ວໄປຍັງໄນລອນ ຫຼືນິໂຕຣເຊລລູໂລສ, ແລ້ວຕຶງຕົວຢ່າງດ້ວຍການເຊື່ອມພັນທະດ້ວຍ UV ຫຼືການອົບ ເພື່ອບໍ່ໃຫ້ຕົວຢ່າງຫຼຸດອອກລະຫວ່າງການຍ້ອມສີ.
2. ຂັ້ນຕອນທີ່ເລືອກເຮັດໄດ້ ແຕ່ມັກໃຊ້ກັນ: ແຊ່ແຜ່ນເມມເບຣນໃຫ້ປຽກໃນກົດອາເຊຕິກ 5 percent ປະມານ 15 minutes.
3. ຍ້ອມສີ 5 ຫາ 10 minutes ໃນເມທິລີນບລູ 0.02 ຫາ 0.04 percent ໃນໂຊດຽມອາເຊເຕດ 0.3 ຫາ 0.5 M ທີ່ pH ໃກ້ 5.2.
4. ລ້າງ ແລະລ້າງສີອອກດ້ວຍນ້ຳ 5 ຫາ 15 minutes, ບັນທຶກຜົນ, ແລ້ວກຳຈັດສີທີ່ເຫຼືອກ່ອນການປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ.

ໄນລອນທີ່ມີປະຈຸບວກເປັນວັດສະດຸຫຼັກໃນງານ Northern. ນິໂຕຣເຊລລູໂລສກໍໃຊ້ໄດ້ດ້ວຍຂັ້ນຕອນກົດອາເຊຕິກ ແລະອາເຊເຕດແບບດຽວກັນ. ຮູບທີ່ໄດ້ໃຊ້ເພື່ອຢືນຢັນການຖ່າຍໂອນ, ປຽບທຽບແຖບ 28S ແລະ 18S (ຫຼື 23S ແລະ 16S ສຳລັບ RNA ຂອງແບັກທີເຣຍ), ໝາຍຕຳແໜ່ງແຖບຂັ້ນບັນໄດ ແລະສານມາດຕະຖານ, ແລະເກັບບັນທຶກເພື່ອປັບຄ່າຕາມປະລິມານ RNA ທັງໝົດແບບຄ່າວໆ. ວິທີ Northern ທີ່ຕີພິມແລ້ວວັດປະລິມານແຖບໄຣໂບໂຊມທີ່ຍ້ອມສີ ເພື່ອກວດສອບການໃສ່ຕົວຢ່າງ, ລວມທັງງານວິທະຍາສາດດ້ານນົມທີ່ໃຊ້ແຖບໄຣໂບໂຊມທີ່ຍ້ອມດ້ວຍເມທິລີນບລູເພື່ອປັບຄ່າມາດຕະຖານ. ແຜ່ນເມມເບຣນ Southern ສາມາດເຮັດໃຫ້ເຫັນແຖບດ້ວຍວິທີດຽວກັນ, ແຕ່ສີຍ້ອມນີ້ມີການໃຊ້ທີ່ຍອມຮັບກັນຫຼາຍກວ່າສຳລັບກວດສອບການໃສ່ຕົວຢ່າງ ແລະການຖ່າຍໂອນໃນ Northern. ນອກຈາກນັ້ນ, DNA ສຳລັບ Southern ຖືກແຍກສາຍກ່ອນການຖ່າຍໂອນ, ດັ່ງນັ້ນຄ່າຄວາມໄວໃນການກວດພົບໃນເຈວຈຶ່ງບໍ່ສາມາດນຳມາໃຊ້ໂດຍກົງ.

ຂີດຈຳກັດການກວດພົບ ແລະສີພື້ນຫຼັງ: ຈຸດທີ່ສີຟ້າເສຍປຽບ

ການປຽບທຽບຂ້າງລຸ່ມເປັນຄ່າປະມານໂດຍຕັ້ງໃຈ. ປະສິດທິພາບຂອງສີຍ້ອມຂຶ້ນກັບເປີເຊັນເຈວ, ຄວາມກວ້າງຂອງແຖບ, ລະບົບແສງ ແລະຄວາມສະໝ່ຳສະເໝີໃນການລ້າງສີ. ໃຫ້ຖືແຕ່ລະຕົວເລກເປັນລະດັບຂະໜາດໂດຍປະມານ, ບໍ່ແມ່ນຂໍ້ກຳນົດຕາຍຕົວ.

ການຄວບຄຸມສີພື້ນຫຼັງເປັນຕົວຕັດສິນວ່າສັນຍານທີ່ບໍ່ແຮງນີ້ຈະໃຊ້ໄດ້ຫຼືບໍ່. ສີຍ້ອມທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັບມີສີເຂັ້ມຫຼາຍ, ດັ່ງນັ້ນຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງແຖບກັບພື້ນຫຼັງຈຶ່ງເກີດຈາກການກຳຈັດສີທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັບ ໂດຍບໍ່ລ້າງສີທີ່ຈັບຢູ່ອອກ. ສີຍ້ອມທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນກວ່າບໍ່ຄ່ອຍເພີ່ມຄວາມໄວໃນການກວດພົບ. ສ່ວນໃຫຍ່ມັນພຽງແຕ່ເພີ່ມເວລາລ້າງສີ. ທົດລອງຊຸດຕົວຢ່າງເຈືອຈາງເປັນລຳດັບດ້ວຍເຈວ, ແຜ່ນເມມເບຣນ ແລະກ້ອງທີ່ຈະໃຊ້ຈິງ, ແລະໃຊ້ສະເພາະຊ່ວງທີ່ຄ່າຄວາມເຂັ້ມລວມຂອງແຖບຍັງເປັນສັດສ່ວນກັບປະລິມານທີ່ໃສ່. ເມທິລີນບລູຊ່ວຍໃນການປັບຄ່າຕາມປະລິມານຕົວຢ່າງແບບເຄິ່ງປະລິມານ. ມັນບໍ່ແມ່ນການທົດສອບເຊິງປະລິມານທີ່ມີຊ່ວງການວັດກວ້າງ, ເພາະຄວາມຈຸຂອງແຜ່ນເມມເບຣນ, ປະສິດທິພາບການຖ່າຍໂອນ, ການອີ່ມຕົວ ແລະການລ້າງສີແຕກຕ່າງກັນໃນແຕ່ລະຊ່ອງ.

ຂໍ້ຈຳກັດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້: ສິ່ງໃດຍັງໃຊ້ໄດ້ຫຼັງການຍ້ອມສີ

ມີການສະແດງແລ້ວວ່າສາມາດໂຄລນຫຼັງການຍ້ອມສີຟ້າ. ຟລໍເຣສ ແລະຄະນະຕັດແຖບອາກາໂຣສທີ່ຍ້ອມສີ, ເກັບຄືນ DNA, ເຊື່ອມຕໍ່ DNA ແລະນຳເຂົ້າສູ່ເຊລ, ໂດຍລາຍງານວ່າການໂຄລນໄດ້ຜົນດີກວ່າຫຼັງການໃຊ້ເອທິດຽມໂບຣມາຍກັບ UV. ສາເຫດທີ່ເປັນໄປໄດ້ແມ່ນຄວາມເສຍຫາຍຈາກແສງທີ່ໜ້ອຍກວ່າ, ບໍ່ແມ່ນປະໂຫຍດຈາກສີຍ້ອມເອງ. ຈຳກັດການສ່ອງແສງຂາວໃຫ້ສັ້ນ ແລະນຳ DNA ທີ່ເກັບຄືນໄດ້ຜ່ານຂັ້ນຕອນທຳຄວາມສະອາດສຳລັບການສະກັດຈາກເຈວຕາມປົກກະຕິ.

ຫຼັກຖານສຳລັບ PCR ແລະການຫາລຳດັບເບສມີໜ້ອຍກວ່າ. ສີຍ້ອມທີ່ຕົກຄ້າງຈັບກັບກົດນິວຄລີອິກ, ດັ່ງນັ້ນໃຫ້ລ້າງສີ ແລະທຳຄວາມສະອາດກ່ອນຂັ້ນຕອນທີ່ໃຊ້ເອນໄຊມ໌. ຄາດວ່າ DNA ຈາກເຈວທີ່ຍ້ອມສີຟ້າ ແລະຜ່ານການທຳໃຫ້ບໍລິສຸດຢ່າງຖືກຕ້ອງຈະໃຊ້ໄດ້, ແຕ່ຍັງບໍ່ມີການວັດປະລິມານຢ່າງຊັດເຈນວ່າໂພລີເມີເຣສຊະນິດຕ່າງໆ ແລະເຄມີການຫາລຳດັບເບສຈະທົນຕໍ່ສີທີ່ຕິດໄປໂດຍກົງໄດ້ຫຼາຍປານໃດ. ຢ່າຄາດເດົາວ່າຈະທົນໄດ້.

ການປະສົມສາຍນິວຄລີອິກເທິງບລັອດເຂົ້າກັນໄດ້ ເມື່ອປະຕິບັດຕາມລຳດັບຢ່າງເຄັ່ງຄັດ: ຖ່າຍໂອນ, ຕຶງຕົວຢ່າງ, ຍ້ອມສີ, ບັນທຶກຜົນ, ລ້າງສີ, ປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ. ລຳດັບນີ້ເປັນການອອກແບບຂອງເຮີຣິນ ແລະຊະມິດ. ການຍ້ອມສີກ່ອນຖ່າຍໂອນ ຫຼືຂ້າມການລ້າງສີ ເປັນວິທີທີ່ຕ່າງອອກໄປ ແລະຕ້ອງມີການຢືນຢັນແຍກຕ່າງຫາກ. ຫຼັງກຳຈັດສີຍ້ອມແລ້ວ, ສາມາດລ້າງໂພຣບອອກ ແລະກວດດ້ວຍໂພຣບອີກຕາມວິທີມາດຕະຖານໄດ້ຕາມປົກກະຕິ. ສຳລັບການຍ້ອມສີລະດັບເຊລດ້ວຍສີໃນກຸ່ມດຽວກັນ ແລະເຫດຜົນທີ່ຫຼັກການຂອງຟິມທີ່ຕຶງແລ້ວບໍ່ສາມາດນຳໄປໃຊ້ກັບວິທີສຳລັບເຊລມີຊີວິດ, ເບິ່ງຄູ່ມືພາບການຍ້ອມສີສຳລັບກ້ອງຈຸລະທັດ.

ການຕັດແຖບໃຊ້ໄດ້ກັບອາກາໂຣສທີ່ຈະເກັບຕົວຢ່າງໄປໃຊ້ຕໍ່ ແລະໂອລິໂກນິວຄລີໂອໄທດ໌ໃນ PAGE ທີ່ຫາຕຳແໜ່ງດ້ວຍສີຟ້າ, ໂດຍຕ້ອງຫຼີກລ້ຽງວິທີຕຶງສີແບບຖາວອນ. ການຊະຕົວຢ່າງອອກດ້ວຍໄຟຟ້າຫຼັງລ້າງສີມີຄວາມເປັນໄປໄດ້ທາງເຄມີສຳລັບສານທີ່ຈັບແບບປີ້ນກັບໄດ້, ແຕ່ຂໍ້ມູນຜົນຜະລິດຈາກການທົດລອງທີ່ຄວບຄຸມ ແລະຈຳເພາະຕໍ່ເມທິລີນບລູຍັງມີໜ້ອຍ. ໃຫ້ກຳຈັດເກືອ ຫຼືຕົກຕະກອນຫຼັງການຊະອອກ.

ບັນຫາທີ່ເກີດຊ້ຳເລື້ອຍໆ

ແຖບໃນເຈວທີ່ຈາງມັກໝາຍເຖິງມວນຕົວຢ່າງທີ່ນ້ອຍເກີນໄປສຳລັບສີຍ້ອມທີ່ອ່ານດ້ວຍສີ, ໂດຍສະເພາະເປົ້າໝາຍສາຍດ່ຽວສັ້ນ ຫຼື RNA. ໃສ່ຕົວຢ່າງໃຫ້ຫຼາຍຂຶ້ນ, ໃຊ້ສີຍ້ອມໃໝ່, ຂະຫຍາຍເວລາຍ້ອມສີກ່ອນເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ ແລະຢຸດລ້າງສີໃຫ້ໄວຂຶ້ນ. ເຈວທີ່ເປັນສີຟ້າທົ່ວທັງແຜ່ນ ແລະບໍ່ເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງຂອງແຖບ ມັກໝາຍເຖິງການຍ້ອມສີຫຼາຍເກີນໄປ ຫຼືປ່ຽນນ້ຳໜ້ອຍເກີນໄປ. ແຖບ PAGE ທີ່ຈາງລົງເປັນພຶດຕິກຳທາງເຄມີທີ່ຄາດໄດ້, ບໍ່ແມ່ນການຍ້ອມສີທີ່ລົ້ມເຫຼວ. ໃຫ້ຖ່າຍຮູບໄວ. ສີພື້ນຫຼັງເທິງແຜ່ນເມມເບຣນທີ່ບໍ່ສະໝ່ຳສະເໝີຊີ້ເຖິງຮອຍພັບ, ຟອງອາກາດ, ຮອຍນິ້ວມື, ການແກວ່ງທີ່ບໍ່ສະໝ່ຳສະເໝີ ຫຼືການຖ່າຍໂອນທີ່ເປັນບາງຈຸດ. ຢ່າຕີຄວາມວ່າເປັນການໃສ່ຕົວຢ່າງບໍ່ເທົ່າກັນ ຖ້າບໍ່ມີຕົວຄວບຄຸມການປະສົມສາຍນິວຄລີອິກ. ຮູບແບບແຖບໄຣໂບໂຊມທີ່ຈາງ ແລະເປັນປື້ນອາດໝາຍເຖິງການເສື່ອມສະຫຼາຍ, ແຕ່ກໍອາດເກີດຈາກການຖ່າຍໂອນບໍ່ຄົບ, ປະລິມານ RNA ທັງໝົດນ້ອຍເກີນໄປ (ຊ່ອງທົ່ວໄປໃສ່ຫຼາຍ micrograms ຫາຫຼາຍສິບ micrograms), ຫຼືລ້າງສີຫຼາຍເກີນໄປ. ສີຍ້ອມສະແດງ RNA ໄຣໂບໂຊມທີ່ມີຫຼາຍ. ມັນບໍ່ໄດ້ສະແດງທຣານສະຄຣິບສະເພາະຊະນິດໜຶ່ງ. ວຽກນັ້ນເປັນໜ້າທີ່ຂອງໂພຣບ.

ຄວາມປອດໄພ ແລະການຈັດການໂດຍບໍ່ກ່າວອ້າງເກີນຈິງ

ເມທິລີນບລູຈັດການໄດ້ງ່າຍກວ່າເອທິດຽມໂບຣມາຍ, ແຕ່ບໍ່ໄດ້ປອດອັນຕະລາຍ. ເອກະສານຂໍ້ມູນຄວາມປອດໄພປັດຈຸບັນຂອງ MilliporeSigma ຈັດສີຍ້ອມນີ້ເປັນສານທີ່ມີຄວາມເປັນພິດສ້ວຍແຫຼມທາງປາກ ປະເພດ 4, ເປັນອັນຕະລາຍຖ້າກືນກິນ, ແລະຕ້ອງກຳຈັດຜ່ານລະບົບຂອງເສຍທີ່ໄດ້ຮັບອະນຸມັດ ຕາມເອກະສານ SDS ຂອງເມທິລີນບລູຈາກ Sigma-Aldrich. ເອທິດຽມໂບຣມາຍມີຄຳເຕືອນດ້ານຄວາມເປັນພິດຕໍ່ສານພັນທຸກຳທີ່ເຂັ້ມງວດກວ່າ, ລວມທັງຜົນຕໍ່ເຊລສືບພັນທີ່ສົງໄສວ່າອາດເກີດຂຶ້ນ ໃນເອກະສານ SDS ຂອງເອທິດຽມໂບຣມາຍຈາກ Sigma-Aldrich. ເຈວ ແລະສານລະລາຍຂອງມັນມັກຖືກແຍກເປັນຂອງເສຍເຄມີອັນຕະລາຍ, ດັ່ງທີ່ລະບຸໃນຄູ່ມືສີຍ້ອມກົດນິວຄລີອິກຂອງ Thermo Fisher. ປະຕິບັດຕາມ SDS ແລະກົດລະບຽບຂອງສະຖາບັນສຳລັບທັງສອງຊະນິດ. ເກັບສີຍ້ອມແຫ້ງໃຫ້ປິດສະໜິດ ແລະແຫ້ງ, ນຳສານຍ້ອມສີທີ່ໃຊ້ງານແລ້ວກັບມາໃຊ້ຊ້ຳສະເພາະຕາມທີ່ວິທີປະຕິບັດອະນຸຍາດ, ເກັບແຜ່ນເມມເບຣນທີ່ຍ້ອມສີແລ້ວໃຫ້ແຫ້ງລະຫວ່າງແຜ່ນເຈ້ຍກອງ, ແລະຖ່າຍຮູບເຈວກ່ອນທີ່ແຖບຈະແຜ່ກະຈາຍຈົນຫາຍໄປ.

ຈື່ຫຼັກສັ້ນໆສຳລັບໂຕະທົດລອງນີ້ໄວ້. ເຈວທົດສອບວ່າເຫັນແຖບໄດ້ຫຼືບໍ່ເມື່ອໃສ່ຕົວຢ່າງປະລິມານສູງພາຍໃຕ້ແສງຂາວ. ແຜ່ນເມມເບຣນທົດສອບການຖ່າຍໂອນ ແລະການໃສ່ຕົວຢ່າງ ກ່ອນທີ່ໂພຣບຈະເຮັດໜ້າທີ່ກວດພົບຢ່າງໄວສູງ. ສີຍ້ອມຊະນິດດຽວຮອງຮັບທັງສອງວຽກ, ດ້ວຍຄວາມໄວໃນການກວດພົບທີ່ບໍ່ສູງ, ການຈັບທີ່ປີ້ນກັບໄດ້ ແລະລຳດັບຂັ້ນຕອນທີ່ເຄັ່ງຄັດ.