Метилен көгүнүн калибрлөө ийри сызыгын түзүү: бланктар, диапазон жана сызыктуулук

Эки аналитик метилен көгүнүн бир эле баштапкы эритме бөтөлкөсүн колдонуп, ар бири калибрлөө ийри сызыгын түзөт. Биринчиси координаталар башталышынан өткөн түз сызык алып, концентрациясы белгисиз үлгүлөрдү ишенимдүү өлчөйт. Экинчисинде жогорку бөлүгү ийилген сызык, нөлгө жакындабаган ордината огу менен кесилиш жана суюлтууга жараша өзгөргөн үлгү натыйжалары чыгат. Боёк, аспап жана толкун узундугу бирдей. Айырма чеберчиликте эмес. Ал тажрыйбанын түзүлүшүндө: бланктын курамына эмне киргенинде, кайсы концентрациялар тандалганында жана текшерилген диапазон бир жөнөкөй модель дагы эле жарактуу болгон аймакта калган-калбаганында.

Калибрлөө ийри сызыгы — аспаптын жообу менен концентрациянын ортосундагы макулдашуу; ал түзүлгөн шарттарда гана жарактуу. Метилен көгү үчүн бул макулдашуунун белгилүү алсыз жери бар. Боёк сууда өз ара биригет, ошондуктан жарыкты сиңирген бөлүкчөлөрдүн түрү концентрацияга жараша өзгөрөт. Ушул өзгөрүүнү камтыган ийри сызык түз болбойт жана аны эч кандай статистика оңдой албайт. Бул макала сызык маанилүү болушу үчүн аны кантип түзүүнү көрсөтөт: туура бланкты тандоо, диапазонду мономердик режимде кармоо, кайталоолорду чындап көз карандысыз жүргүзүү жана ийилүүнү ызы-чуу эмес, маалымат катары кароо.

Стандарттардан эмес, бланктан баштаңыз

Бланк нөлдү аныктайт жана метилен көгү үчүн анда боёктон башка бардык нерсе болушу керек. Суунун сапат классы, буфер жана pH, туздар, кошо эриткичтин үлүшү, температура — баары бирдей болушу зарыл. Калибрлөө эритмелерин дал ошол матрицада даярдаңыз. Мунун себеби формалдуулукта эмес, химияда. Туз жана эриткич мономер, димер жана жогорку тартиптеги агрегаттардын ортосундагы тең салмактуулукту жылдырып, өлчөө толкун узундугундагы спектрди өзгөртөт. Жалаң суудан турган бланк матрица себеп болгон бөлүкчө түрлөрүнүн өзгөрүшүн оңдой албайт. Метилен көгүнүн суудагы спектрлеринин глобалдык талдоосунда, аны ачык жеткиликтүү жазуусу аркылуу окууга болот, натрий хлоридинин концентрациясы 0 ден 0.15 M ге чейин өзгөртүлгөн. Себеби иондук күч тең салмактуулукту жылдырат, ал эми туз көбөйгөндө агрегатташуу күчөгөн.

Практикалык бир жыйынтык: эч качан деиондоштурулган сууда калибрлеп, андан кийин үлгүлөрдү фосфат буферинде же агынды суунун фильтратында өлчөбөңүз. Аналитсиз матрица жок болсо, үлгүнүн өзүнө стандартты кошуу матрицасы дал келбеген тышкы ийри сызыктан артык. Суудагы анализдердин ишенимдүүлүгүн сактоо боюнча тиешелүү көрсөтмөлөр матрица жана тоскоолдук таасирлер тууралуу талкууда берилген, ал эми боёкторду сандык талдоонун жалпы принциптери анализди пландоо боюнча серепте каралган.

Бир түр басымдуулук кылган диапазонду тандаңыз

664 nm ге жакын узун толкундуу тилкеде сандык аныктоо боёктун көпчүлүгү мономер түрүндө деген божомолго таянат. Кадимки сууда бул божомол эритмелер суюлтулган бойдон, болжол менен төмөн микромолярдык аймакта турганда гана жарактуу. Жарыяланган эмпирикалык эңкейиш коэффициенттери бул чекти көрсөтөт: 1 cm кюветаларда болжол менен 7 микромолярдан төмөн кармалган калибрлөөлөрдө эңкейиш 82,000 M-1 cm-1 ге жакын болот, ал эми болжол менен 37 микромолярга чейин кеңейтилген калибрлөөдө ал болжол менен 67,100 ге түшөт, анткени жогорку концентрациядагы стандарттарда димердин үлүшү ансыз деле олуттуу. Бул жерде келтирилген ар бир коэффициенттин шарттары метилен көгүнүн спектрдик маалымдамасында көрсөтүлгөн; сандарды салыштыруу үчүн ошол булак ылайыктуу. Бул макала аларды диапазонду белгилөө үчүн гана колдонот.

Мындан түздөн-түз төмөнкү пландоо эрежелери келип чыгат:

1. Эң жогорку концентрациядагы стандартты спектрдин формасы туруктуу калгыдай суюлтулган абалда кармаңыз. Методду иштеп чыгууда ар бир деңгээл үчүн бир толкун узундугун гана өлчөбөстөн, бүт көрүнүүчү диапазонду (болжол менен 550 ден 750 nm ге чейин) сканерлеңиз. Нормалдаштырылган спектрлердин формасы концентрацияга жараша өзгөрсө, химиялык абал өзгөрүп жатат жана диапазон өтө кең.
2. Ар бир деңгээлде 610 nm ге жакын оптикалык тыгыздыктын 665 nm ге жакын оптикалык тыгыздыкка катышын көзөмөлдөңүз. Катыш концентрация менен кошо өссө, димерге тиешелүү спектрдик ийин күчөп, мономердик модель жараксыз болуп бара жатат. Бул диагностикалык белги агрегатташуу жана концентрациянын таасири боюнча колдонмодо кененирээк түшүндүрүлгөн.
3. Төмөн микромолярдык концентрациялар менен иштөөдө 1 cm кюветаны колдонуңуз. Эңкейиш 82,000 ге жакын болгондо, 5 микромолярда оптикалык тыгыздык 0.41 ге жакын, ал эми 10 микромолярда болжол менен 0.82 болот; эки маани тең көпчүлүк аспаптар үчүн ыңгайлуу.
4. Концентрацияланган баштапкы эритмелер үчүн оптикалык тыгыздыктын 1 ден кыйла жогору болушуна макул болбостон, оптикалык жолду кыскартыңыз. Бирок кыска жол фотометриялык маселени гана чечип, химиялык маселени чечпесин эсиңизден чыгарбаңыз. Агрегатташуу жолдун узундугуна эмес, концентрацияга көз каранды. Ошондуктан концентрацияланган баштапкы эритме үчүн суюлтулган мономердин ийри сызыгы эмес, бөлүкчө түрлөрүнүн курамын эске алган өзүнчө мамиле талап кылынат.

Бул түшүнүктөрдүн көбүнө негиз болгон глобалдык моделдик шайкештөө 1.1 микромолярдан 3.4 миллимолярга чейинки 224 спектрди камтып, тетрамердин сигналы 34 микромолярдан төмөн концентрацияларда эле аныкталарын көрсөткөн. Бул табылга мамилени аныктайт: сызыктуу аймак интуиция болжогондон тар, ошондуктан аны бар деп кабыл албай, текшериңиз.

Деңгээлдер, кайталоолор жана тартип

Үч чекиттен турган ийри сызык эч нерсени далилдебейт. ICH Q2(R2) валидация көрсөтмөлөрү сызыктуулукту баалоо үчүн кеминде беш концентрацияны талап кылат, ал эми нөлдөн башка алтыдан сегизге чейинки деңгээл кыйла ишенимдүү жумушчу ийри сызыкты берет, айрыкча агрегатташуу башталган жогорку бөлүктө. Деңгээлдерди ыңгайлуулук үчүн тандалган геометриялык катар боюнча эмес, үлгүлөрдүн күтүлгөн диапазонун камтыгыдай жана ийилүү ыктымал болгон жерлерде тыгызыраак болгудай жайгаштырыңыз.

Ар бир деңгээлди эки же үч кайталоодо өлчөңүз; алар бир колбадан үч жолу өлчөнбөстөн, өз алдынча даярдалышы керек. Көз карандысыз кайталоолор даярдоодогу катаны ачып берет; бир колбаны кайра-кайра өлчөө аспаптын ызы-чуусун гана көрсөтөт. 2020-жылдагы глобалдык изилдөөдө ар бир эритме үч жолу өлчөнгөн, бул дагы эле негиздүү демейки ыкма. Дрейф, айнекке адсорбциялануу же температуранын өзгөрүшү ийилүү болуп көрүнбөшү үчүн өлчөө тартибин туш келди кылыңыз. Кварц кюветаларды изилдөөдө 34 микромолярдык эритмедеги боёктун болжол менен 3 пайызы 10 мүнөт ичинде адсорбцияланары аныкталган. Ошондуктан серия боюнча тийишүү убактысын, кюветаны, тазалоону жана ырааттуулукту бирдей кармаңыз.

Көрсөтмөлүү эсептөө мисалы (өлчөнгөн маалымат эмес)

Төмөнкү сандар эсептөө жолун көрсөтүү үчүн ойдон чыгарылган. Алар лабораториялык өлчөөлөр эмес жана метилен көгү боюнча маалымат катары келтирилбеши керек. Маанилүүсү — бул сандарга байланыштуу текшерүүлөрдүн тартиби.

Дал келген буферде даярдалган алты стандарт 1 cm оптикалык жолдо, 665 nm де, матрицасы дал келген бланкка салыштырылып өлчөндү деп алалы:

Орточо оптикалык тыгыздыкты концентрацияга карата түз сызык менен шайкештөө эңкейишти микромолярга 0.0805 оптикалык тыгыздык бирдигине жакын, ал эми ордината огу менен кесилишти нөлдөн бир нече миллиоптикалык тыгыздык бирдигинен ашпаган аралыкта берет. Эңкейишти оптикалык жолдун узундугуна бөлүү аны көрүнмө сиңирүү коэффициентине айлантат: микромолярга 0.0805 болжол менен 80,500 M-1 cm-1 ге барабар, бул сууда мономер басымдуулук кылган аралыкка шайкеш келет. Маанилүү текшерүү — R квадраты эмес, анткени ал кандай болгон күндө да мыкты көрүнөт. Маанилүүсү — нөлгө жакын кесилиш, S2 ден S5 ке чейинки туруктуу A610/A665 катышы жана эч кандай тенденциясыз чачыраган калдык четтөөлөр. S6 да катыштын жогорулашы ошол деңгээлди алып салууга же 7 микромолярды бул матрица менен аспаптын айкалышы үчүн убактылуу жогорку чек деп белгилөөгө ачык негиз берет.

Бирдей шарттарда 0.245 деп өлчөнгөн белгисиз үлгү түздөн-түз эсептелет: 0.245 ти микромолярга 0.0805 ке бөлгөндө, үлгүнүн суюлтуу коэффициентин колдонууга чейин болжол менен 3.0 микромоляр чыгат. Натыйжаны анын шарттары менен кошо бериңиз: толкун узундугу, оптикалык жол, бланктын матрицасы, калибрлөө аралыгы жана дата.

Толтурулуучу калибрлөө иш барагы

Ар бир жаңы матрица үчүн бул шаблонду лабораториялык журналга көчүрүңүз. Бир матрица, бир барак, бир ийри сызык.

Реагенттин формасы үчүн сап бекеринен берилген эмес. Коммерциялык метилен көгү суусуз туз же тригидрат сыяктуу гидрат болушу мүмкүн; туура эмес молярдык масса ар бир номиналдык концентрацияны байкалбай системалуу бурмалайт. Баштапкы материалдын тазалыгын жана спецификациясын текшерүү сапат жана сапат класстары боюнча колдонмодо каралган.

Көз карандысыз текшерүү стандарты менен ырастоо

Калибрлөө ийри сызыгы өз ишин өзү баалабашы керек. Модель шайкештелгенден кийин, өзүнчө таразаланган баштапкы эритмеден кабыл алынган аралыктын ортосуна жакын концентрациядагы бир текшерүү стандартын даярдап, аны белгисиз үлгү катары өлчөңүз. Бир нече пайыз чегиндеги дал келүү даярдоо чынжырынын тууралыгын ырастайт; дал келбөө аспаптан эмес, баштапкы эритмеден же суюлтуулардан шектенүүгө негиз берет. Текшерүү стандартын үлгүлөрдүн ар бир сериясы менен кайра өлчөңүз. Ийри сызык өзгөрбөй туруп, анын көрсөткүчү жылса, үлгүлөрдөн мурда жумушчу эритмелерди же кюветаны текшериңиз. Ушул бир эле адат байкалбай калган каталардын көбүн кармайт: суусуз реагентке гидраттын молярдык массасын колдонуу, калибрлөөсү бузулган микропипетка, туура эмес иондук күчтө даярдалган буфер. Текшерүү стандартынын табылган концентрациясынын күтүлгөнгө катышын иш барагына эңкейиштин жанына жазыңыз. Ошондо кийин окуган адам сызык жөн гана чийилбестен, текшерилгенин көрөт.

Сызыктуу эместикти диагностикалык белги катары чечмелөө

Ийри сызык ийилгенде, четтөөнүн формасы анын себебин көрсөтөт. Спектрдин формасы өзгөрбөй туруп, жогорку оптикалык тыгыздыкта ылдый ийилүү аспапка ишарат кылат; көп учурда чачыранды жарык чоң оптикалык тыгыздыктарды төмөн көрсөтөт. 610 nm деги спектрдик ийиндин өсүшү менен коштолгон ийилүү химияга ишарат кылат: димер жана жогорку тартиптеги агрегаттар мономерден башкача сиңирет. Нөлгө келбеген бланк же көрсөткүчтөрү убакыт өткөн сайын төмөндөгөн стандарттар идишке байланышкан маселени көрсөтөт: айнекке же кюветаларга адсорбциялануу, айрыкча серия ичинде тийишүү убактысы ар башка болсо. Ал эми чекиттер аркылуу өткөн так түз сызык үлгүлөр үчүн дагы эле туура эмес натыйжа берсе, бул матрицага ишарат кылат: үлгүлөр калибрлөө эритмелеринен айырмаланат. Андайда ийри сызыкты үлгүнүн матрицасында кайра түзүңүз же стандартты кошуу ыкмасына өтүңүз. Ар бир учурда калдык четтөөлөрдү концентрацияга карата графикке түшүрүңүз. Туш келди чачыроо түз сызыктуу моделди колдойт; өйдө же ылдый жаа сымал көрүнүш аны R квадратынын кандай гана босогосуна караганда болбосун ишенимдүүрөөк четке кагат. Валидация көрсөтмөлөрү бул ойду ачык колдойт.

Метилен көгү мындай тартиптүү мамиленин үзүрүн көрсөтөт. Анын мономердик тилкеси күчтүү, химиясы жакшы изилденген жана четтөөлөр сандарды бурмалаганга чейин спектрде билинет. Ийри сызыкты тар диапазондо түзүңүз, туура бланкты колдонуңуз, кайталоолорду көз карандысыз даярдаңыз жана диапазонду тандоодо спектрлердин формасына таяныңыз. Натыйжадагы сызык кыска болот, бирок анын ар бир чекити ишенимдүү.

Бул макаладагы көрсөтмөлүү эсептөөлөр ыкманы түшүндүрүү үчүн ойдон чыгарылган сандарды колдонот. Толук шарттары менен өлчөнгөн маалымдама коэффициенттери шилтемеленген спектрдик маалымдамада берилген, ал эми негиз болгон агрегатташуу изилдөөсү PMID 33251415 боюнча индекстелген.