G6PD лабораториялык тесттериндеги метилен көгү: боёк чындыгында эмне кылат

Студент инкубациядан кийин эки пробирканы карап турат. Биринин түсү күтүлгөндөй өзгөрдү. Экинчисиники өзгөргөн жок. Студент экинчи бейтапта глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа жетишсиз деген тыянак чыгарат. Бул тыянак туура болушу мүмкүн, бирок мындай ой жүгүртүү тесттин иштешин түшүндүргөн негизги түшүнүктү көз жаздымда калтырат. Пробиркадагы эч нерсе ферментти түздөн-түз өлчөбөйт. Пробирка метилен көгүн ортомчу катары колдонуп, фермент пайда кылган нерсени өлчөйт.

Бул кыйыр байланыш түшүнүктүү болгондо, жол-жобо, контролдук үлгүлөр жана жалган натыйжалардын узун тизмеси негизсиз көрүнбөй калат.

Кыскача жооп

G6PD тестинде метилен көгү кычкылдануу-калыбына келүү индикатору болуп кызмат кылат. G6PD ферменти NADPH пайда кылат, ал эми NADPHга көз каранды системалар көк түстөгү метилен көгүн анын түссүз лейко формасына чейин калыбына келтирет же аны электрондорду ташуу үчүн колдонот. Ферменттин нормалдуу активдүүлүгү натыйжалуу калыбына келүүнү камсыздайт. Активдүүлүк жетишсиз болсо, калыбына келүү жай же толук эмес жүрөт. Тесттин сигналы ушундан турат.

Тарыхый эки ыкма бир эле боёкту колдонот, бирок акыркы көрсөткүчү менен айырмаланат. Аларды бири-биринен ажырата билсеңиз, түшүнбөстүктөрдүн көбү жоголот.

Эки тест, бир боёк, ар башка акыркы көрсөткүчтөр

Биринчиси — Sass жана кесиптештери сүрөттөгөн, кийин Gibbs баалаган метилен көгүн түз калыбына келтирүү тести. Мында акыркы көрсөткүч боёктун өзү болот: кычкылданган көк түстөгү метилен көгү түссүз лейкометилен көгүнө чейин калыбына келет, ал эми бул өзгөрүүнүн ылдамдыгы NADPH пайда кылуу жөндөмүн чагылдырат. Скрининг боюнча алгачкы макала PubMed базасында Sass жана башкалардын (1966) эмгеги катары катталган.

Экинчиси — Brewer метгемоглобинди калыбына келтирүү тести. Алгач натрий нитрити гемоглобинди күрөң түстөгү метгемоглобинге чейин кычкылдандырат. Андан соң метилен көгү электрондорду өткөрүүчү ортомчу катары иштейт: калыбына келген метилен көгү калыбына келтирүүчү эквиваленттерди метгемоглобинге өткөрүп, аны кайра кызыл түстөгү гемоглобинге айлантат. Демек, көзгө көрүнгөн акыркы көрсөткүч көк менен түссүздүн эмес, күрөң менен кызылдын айырмасы болот. Баштапкы ыкма Дүйнөлүк саламаттык сактоо уюмунун бюллетенинде (Brewer жана башкалар, 1960) жарыяланган.

Brewer анализин боёкту түссүздөндүрүү тести деп атоо химиялык жактан так эмес. Боёк цикл менен өзгөрүп турат; түсүн гемоглобин өзгөртөт. Төмөнкү схема эки жолду тең көрсөтөт.

Негизги реакция

G6PD пентозофосфаттык жолдун биринчи кычкылдануу баскычын катализдейт:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Жетилген эритроциттер NADPH алуу үчүн бул жолго кыйла көз каранды; бул Blood журналында Luzzatto жана кесиптештеринин сереп макаласында (2020) каралган. NADPH глутатионду калыбына келген абалда кармап, клетканы кычкылдануудан болгон зыяндан коргойт. Метилен көгү бул системага электрон кабыл алуучу катары кошулат. G6PD жетиштүү болсо, NADPH да жетиштүү болот, бул натыйжалуу калыбына келүүгө шарт түзөт. G6PD аз болсо, чынжыр биринчи звеносунан үзүлөт.

Боёкту кыймылдаткыч эмес, күйүүчү майдын деңгээлин көрсөткүч катары элестетиңиз. Ал NADPH менен камсыз болууну көрсөтөт. Бул камсыздоого же көрсөткүчтү окууга таасир эткен башка нерселер генде эч кандай өзгөрүү болбосо да көрсөткүчтү жылдыра алат.

Brewer тибиндеги жол-жобо кантип жүргүзүлөт

Реагенттердин курамы ондогон жылдар бою өзгөрүп келген, ошондуктан окуу үчүн берилген сүрөттөмөнү клиникалык протокол катары кабыл алууга болбойт. Ар бир лаборатория өзүнүн валидацияланган стандарттык иштөө жол-жобосун карманат. Ушуну эске алуу менен, үч пробирка жана 3 сааттык инкубация колдонулган бул жарыяланган ишке ашыруу мисалында баяндалган классикалык пробиркалык тест төмөнкүдөй жүргүзүлөт:

1. Бейтаптын пробиркасы: бүтүн канга глюкоза, натрий нитрити жана метилен көгү кошулат. Нитрит метгемоглобинди пайда кылат, глюкоза эритроциттердин зат алмашуусуна азык берет, ал эми боёк NADPHга көз каранды электрон ташууну камсыздайт.
2. Кычкылданган контролдук үлгү: канга нитрит жана глюкоза кошулат, бирок метилен көгү кошулбайт. Ал метгемоглобиндин күрөң түстөгү акыркы көрсөткүчүн — жетишсиздикке мүнөздүү көрүнүштү көрсөтөт.
3. Гемоглобиндин контролдук үлгүсү: канга суу кошулат. Ал гемоглобиндин кызыл түстөгү акыркы көрсөткүчүн — нормалдуу көрүнүштү көрсөтөт.
4. Бардык пробиркаларды 37 Cге жакын температурада, адатта 3 саат бою акырын аралаштырып инкубациялаңыз.
5. Клеткаларды лизиске учуратып, түстөрдү салыштырууну жеңилдетүү үчүн ар бир пробиркадан алынган кичине аликвотаны дистилденген сууга суюлтуңуз.
6. Бейтаптын пробиркасын эки контролдук үлгү менен салыштырыңыз. Түстүн кайра кызылга жакындашы калыбына келтирүү жөндөмүнүн олуттуу экенин көрсөтөт. Күрөң түстүн сакталышы айкын жетишсиздикти болжолдойт.

Тарыхый курамдардын биринде болжол менен 1 mL кан жана концентрациялары 180 mM натрий нитритине, 280 mM декстрозага жана 0.4 mM метилен көгүнө жакын реагенттер колдонулган. Бул сандарды жалпыга бирдей талап эмес, адабияттагы мисал катары кабыл алыңыз.

Натыйжаны чечмелөө

Сапаттык скрининг нормалдуу активдүүлүктүн болжол менен 30–40 пайызынын тегерегинде эң жакшы айырмалайт; бул Malaria Journal журналындагы G6PDни аныктоодогу кемчиликтер тууралуу серепте талкууланган. Ошондуктан скринингдин нормалдуу натыйжасы анализ оор жетишсиздикти аныктабаганын билдирет. Ал активдүүлүктүн толук нормалдуу экенин ырастабайт.

Скрининг эмне үчүн жаңылтат

Гемолизден кийинки ретикулоцитоз — жалган нормалдуу натыйжанын классикалык себеби. Жаш эритроциттерде жана ретикулоциттерде G6PD эски клеткаларга караганда көбүрөөк болот. Курч гемолиз учурунда эң эски, фермент жетишсиздиги эң күчтүү клеткалар буга чейин эле бузулуп, артында активдүүлүгү тестте нормалдуу көрүнгөн жаш клеткалардын тобу калышы мүмкүн. Бул биологиялык өзгөчөлүк боёк колдонгон скринингдерди гана эмес, сандык анализдерди да жаңылтат.

Жакында кан куюлган болушу жетишсиздикти жашырат, анткени донордун эритроциттери үлгүгө өз ферментин кошот. Mayo Clinic Laboratories кан куюуну ретикулоцитоз жана лейкоциттердин тоскоолдук кылуучу таасири менен катар фермент боюнча натыйжалардын ишенимсиз болушунун себептеринин бири катары көрсөтөт.

Гетерозиготалуу аялдар — эң татаал учур. X-хромосоманын кокустук инактивдешүүсү нормалдуу жана фермент жетишсиз эритроциттердин аралашмасын пайда кылат; жалпы активдүүлүк өтө төмөндөн сыртынан нормалдуу көрүнгөн деңгээлге чейин өзгөрүшү мүмкүн. Сапаттык скринингдер аралык фенотиптерди көп учурда аныктабай калат. ДСУнун G6PD тесттери тууралуу документинде бул чектөө кеңири талкууланган.

Үлгүнүн эскилиги, сактоо температурасы, акыркы түстү көз менен баалоонун субъективдүүлүгү, гематокрит жана реагенттердин сапаты ушул биологиялык таасирлерге кошумча аналитикалык өзгөрмөлүүлүктү жаратат.

Скрининг — диагноз эмес

Жетишсиздикти көрсөткөн, аралык же клиникалык көрүнүшкө дал келбеген скрининг натыйжасы G6PD ферментинин активдүүлүгүн сандык анализдөө зарылдыгын билдирет. ДСУ температурасы көзөмөлдөнгөн сандык спектрофотометрияны эталондук ыкма деп эсептейт. Бул анализде эритроциттердин гемолизатына глюкоза-6-фосфат жана NADP+ кошулат, ал эми пайда болгон NADPH 340 nm толкун узундугунда жарыкты сиңирүүнүн өсүшү аркылуу көзөмөлдөнөт. Өзгөрүүнүн ылдамдыгы ферменттин активдүүлүгүнө пропорционалдуу болуп, адатта гемоглобинге карата бир граммга туура келген бирдиктер менен көрсөтүлөт. Учурдагы клиникалык-лабораториялык практика Mayo тесттер каталогундагы G6PD активдүүлүгү тууралуу жазууда жалпыланган.

Натыйжаны чечмелөөдө лаборатория валидациялаган референстик диапазон колдонулат; ал көбүнчө популяциядагы нормалдуу активдүүлүккө салыштырмалуу берилет. Жетишсиздик адатта 30 пайыздык босогонун тегерегинде, ал эми аралык активдүүлүк андан жогору деңгээлде талкууланат. ДСУнун G6PD тесттери үчүн максаттуу продукт профилдери (2022) ушул диагностикалык алкакты баяндайт. Эгер жакындагы гемолиз же кан куюу фенотипти аныктоону ишенимсиз кылса, эритроциттердин курамы кайра тең салмакка келгенден кийин тестти кайталоо керек; молекулалык тест ферментти өлчөөнүн ордун баспастан, кошумча маалымат бере алат.

Сактоо зарыл болгон чек

Бул анализдерде метилен көгү — ex vivo лабораториялык реагент. Бул факт метилен көгүн бейтапка берүүнүн коопсуздугу жөнүндөгү талкуудан өзүнчө каралат; ал маселе метилен көгүнүн каршы көрсөтмөлөрү тууралуу нускамада камтылган. Аларды биохимия байланыштырат, анткени дары да NADPHга көз каранды калыбына келүүгө таянат, бирок пробиркадагы боёк — кан агымына киргизилген доза эмес. Боёк башка шартта боёочу зат катары кандай иштээрин түшүнүү үчүн метилен көгү менен боёонун принциптерин, ал эми анын химиялык тобу тууралуу маалымат үчүн лабораториядагы кычкылдануу-калыбына келүү боёктору жөнүндөгү материалды караңыз.

Скрининг калыбына келтирүү жөндөмү сакталгандай көрүнөбү деген суроого жооп издейт. Ырастоочу тест фермент чындыгында канча экенин аныктайт. Боёктон экинчи суроого жооп талап кылынбаса, ал биринчи суроого жакшы кызмат кылат.