Метилен көгү менен ачыткыны сыноо: тирүү клеткаларды саноо жана дем алуу убактысын өлчөө

Лабораториялык үстөлдө эки пробирка турат. Экөө тең көк. Биринде микроскоптон көрүнгөн көк клеткалар ачыткынын өлгөнүн билдирет. Экинчисинде пробирканын көк түстөн түссүзгө өтүшү ачыткынын тирүү экенин жана дем алып жатканын билдирет. Боёк бирдей, бирок жыйынтыктын мааниси карама-каршы. Бул эки сыноону чаташтырсаңыз, бардык тыянактар тескерисине айланат.

Макаланын өзөгү — ушул айырма. Метилен көгү — кычкылдануу-калыбына келүүчү боёк: кычкылданган абалда көк, калыбына келген абалда түссүз лейкометилен көгү болот. Жашоого жөндөмдүүлүктү саноо ушул химиялык касиетти кыска убакыттагы микроскоптук көрүнүштө пайдаланат. Дем алуу тажрыйбасы болсо аны аралашманын жалпы көлөмүндө убактысы өлчөнгөн реакцияда пайдаланат. Ар бирине өзүнчө протокол, өзүнчө контролдор жана өзүнчө сын көз менен баалоо керек.

Жашоого жөндөмдүүлүктү саноо: кыска боёп, дароо баалоо

Сыра өндүрүшүндө колдонулган протокол — эң стандартташтырылган вариант. 2% натрий цитратында 0.01% w/v метилен көгүн даярдап, ачыткы суспензиясы менен 1:1 катышында аралаштырыңыз да, кыска, белгиленген убакыт өткөндөн кийин аралашманы караңыз. Жарыяланган убакыт аралыктары Brewing Science Institute колдонмосундагы 1–2 мүнөттөн изилдөө протоколдорундагы болжол менен 5 мүнөткө чейин өзгөрөт; OIV шарап микробиологиясы ыкмасы кароону 10 мүнөттүн ичинде жүргүзүүнү талап кылат. Саналуучу аралашмадагы боёктун акыркы концентрациясы болжол менен 0.005% болот. Жакшыртылган Neubauer камерасын толтуруп, болжол менен 400x чоңойтууда кочкул көк клеткаларды жашоого жөндөмсүз, ал эми боёлбогон клеткаларды жашоого жөндөмдүү деп бөлүңүз. OIV ыкмасында ачык көк клеткалар тирүү деп эсептелет; бул төмөндө талкууланган субъективдүүлүк маселесин эле көрсөтүп турат.

Клеткалардын концентрациясы камеранын геометриясына жараша эсептелет. Борбордогу капталы 1 mm болгон бүт квадрат саналганда, бир mL ичиндеги клеткалардын саны N, суюлтуу коэффициенти жана 10^4 көбөйтүндүсүнө барабар болот; мында N — ошол аянттагы клеткалардын саны. Бул ASBC ачыткы ыкмаларында баяндалган. Жашоого жөндөмдүүлүктү эсептөө жөнөкөйүрөөк: боёлбогон клеткалардын санын жалпы клеткалардын санына бөлүп, 100гө көбөйтүү керек. FEMS сыра өндүрүшүндөгү салыштырма изилдөөгө жана OIV практикасына ылайык, жашоого жөндөмдүүлүктү баалоо үчүн болжол менен 400 клетка санаңыз. Чек ара боюнча бир эрежени ырааттуу колдонуңуз: мисалы, тордун төмөнкү жана сол сызыктарындагы клеткаларды кошуп, жогорку жана оң сызыктарындагы клеткаларды эсепке албаңыз.

Бүчүрлөр үчүн эрежени саноо башталганга чейин аныктоо керек. Кеңири колдонулган эрежеге ылайык, бүчүр эне клетканын болжол менен жарымындай өлчөмгө жеткенде өзүнчө клетка катары саналат, ал эми андан кичине болсо эне клетка менен бирге эсептелет. Кайсы эрежени тандабаңыз, аны ар бир квадратка бирдей колдонуңуз жана кийинки адам да кайталап колдоно алышы үчүн эсептөө барагына жазыңыз.

Эсептөө барагы (басып чыгарыңыз)

Бул эсептөө барагы атайын ушул макала үчүн түзүлгөн. Аны дептерге көчүрүңүз же ар бир үлгү үчүн бирден басып чыгарыңыз.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, мында N камеранын белгиленген аянтынан алынат. Натыйжанын жанына боёо убактысын жазыңыз, анткени убактысы көрсөтүлбөгөн жашоого жөндөмдүүлүк көрсөткүчүн кайра чыгаруу мүмкүн эмес.

Жашоого жөндөмдүүлүк көрсөткүчтөрү эмне үчүн өзгөрөт

Биринчи тоскоолдук — убакыт, ал эки багытта тең таасир этет. Метаболизмдик жактан активдүү клеткалар боёкту калыбына келтирет, ошондуктан өтө эрте баалоодо тирүү клеткалар бул процессти бүтүрө элек болуп, жаңылыш өлгөн деп эсептелиши мүмкүн. Бирок узак таасир этүү өзү уулуу болуп, чындап жабыркаган көк клеткаларды пайда кылат да, өлүмдү көрсөткөн жалган боёлууга алып келет. Ошондуктан лабораториялык окуу протоколунда баалоону 5 мүнөттүн ичинде жүргүзүү көрсөтүлгөн; бул Висконсиндеги ачыткы боюнча окуу протоколунда баяндалган. Ишенимдүү түшүндүрмө мындай: метилен көгү менен баалоо убакытка көз каранды, ошондуктан бир кыска убакыт аралыгын белгилеп, сериядагы бардык үлгүлөрдө аны өзгөртпөңүз.

Жашоого жөндөмдүүлүгү төмөн үлгүлөрдө экинчи бурмалоо бар. Стандартташтырылган ыкма жашоого жөндөмдүүлүк болжол менен 80%дан төмөн болгондо метилен көгү чыныгы көрсөткүчтү ашыра баалашы мүмкүн экенин эскертет, анткени боёкту дагы эле калыбына келтирген клеткалар көбөйүү жөндөмүн сактабай калышы мүмкүн. Сыра өндүрүшүнө арналган адабияттарда да жашоого жөндөмдүүлүк олуттуу төмөндөгөндө ушундай ишенимсиздик сүрөттөлөт. Метилен көгүн тез, болжолдуу баалоо каражаты катары караңыз. Жашоого жөндөмдүүлүгү төмөн культураны кайра ачытуу үчүн колдонуу сыяктуу маанилүү чечимдерди агар табакчаларында колонияларды саноо же кошумча боёо менен ырастап алыңыз.

Үчүнчү орунда — үлгүнүн чөйрөсүнүн таасири. OIV ыкмасы болжол менен pH 4.6да жүргүзүлөт жана pH деңгээли төмөн, күчтүү буферленген үлгүлөр боёктун туура иштешине тоскоол болорун эскертет. Ошондой эле кант 100 g/Lден жогору болгондо бул сыноону колдонбоо сунушталат, анткени клеткалар жаңылыш баалоого алып келген ачык көк түстө көрүнөт. Боёо учурундагы pH маанилерин тажрыйбада салыштыруу сыналган диапазондо сезгичтик кыйла өзгөрөрүн көрсөткөн; бул метилен көгү ыкмасынын pH деңгээлине көз карандылыгын изилдөөгө шайкеш келет. Калдыктар — өзүнчө тузак: булганган эзмелердеги боёлгон бөлүкчөлөр өлгөн клеткаларга окшоп, операторлордун жыйынтыктарынын ортосундагы айырманы көбөйтөт.

Бул өзгөрмөлүүлүк жөн гана байкоо эмес, сандык түрдө өлчөнгөн. FEMS ачыткыны салыштыруу изилдөөсүндө баяндалган алты айлык сыра өндүрүшүндөгү сыноодо метилен көгү менен кайталанган өлчөөлөрдүн стандарттык четтөөсү орто эсеп менен 6.1% болгон, ал эми оксонол менен агымдык цитометрияда 0.2% болгон. Бир эле үлгү боюнча эки оператордун жыйынтыктарынын айырмасы 13 пайыздык пунктка чейин жеткен. 2023-жылдагы жашоого жөндөмдүүлүктү баалоо ыкмаларын сандык салыштыруу флуоресценттик микроскопия менен агымдык цитометрия кыйла так экенин көрсөтүп, ошол эле учурда ыкманын натыйжалуулугу түргө жана үлгүнүн чөйрөсүнө көз каранды экенин аныктаган. Painting жана Kirsop тарабынан берилген классикалык ыкма баяндоосу (PMID 24430080) негизги таяныч бойдон калууда. Ал эми ачыткынын жашоого жөндөмдүүлүгүн жана физиологиялык активдүүлүгүн сыноолордун кеңири сереби (PMID 25154541) метилен көгүн акыркы чечим берүүчү эмес, толуктоочу сыноолордун катарына коёт. Бул жерде трипан көгү автоматтык түрдө жакшыраак ыкма болуп калбайт: ал мембрананын бүтүндүгүнүн бузулушун көрсөтөт, ал эми метилен көгү клеткага сиңүүнү жана калыбына келтирүүчү активдүүлүктү чагылдырат. Ошондуктан стресске кабылган клеткалар эки боёк менен ар башкача бааланышы мүмкүн.

Дем алуу тажрыйбасы: көк түстүн жоголуу убактысын өлчөө

Экинчи сыноодо микроскоп такыр колдонулбайт. Ачыткы, глюкоза жана суюлтулган метилен көгү жабык пробиркага салынат, ал эми саат көк түс канча убакытта жоголорун өлчөйт. Клеткаларда зат алмашуу жүргөндө көк боёкту түссүз түрүнө айландырган калыбына келтирүүчү эквиваленттер пайда болот, ошол эле учурда эриген кычкылтек аны кайра кычкылдантат. Клеткалар кычкылтектин көлөмүн азайткандан кийин калыбына келүү процесси басымдуу болуп, пробиркадагы эритме түссүздөнөт. Ошондуктан акыркы чекит дем алуунун, боёктун концентрациясынын жана кычкылтектин жеткиликтүүлүгүнүн тең салмактуулугун чагылдырат. Аны молекулалык кычкылтекти керектөөнүн түз ылдамдыгы катары эмес, метилен көгүнүн калыбына келүү же түссүздөнүү убактысы катары көрсөтүү керек.

Убакытты өлчөөгө ыңгайлуу аралык алуу үчүн жашоого жөндөмдүүлүктү баалоодо колдонулгандан кыйла суюк боёкту колдонуңуз. AQA A деңгээлиндеги милдеттүү практикалык иштер колдонмосу муну жакшы стандартташтырат: болжол менен 30 Cге жылытылган ар бир 100 mL сууга 1 g глюкоза, колдонордун алдында дароо кошулган 5 g кургатылган ачыткы жана 1% баштапкы эритменин 0.1 mL көлөмүн 100 mLге чейин суюлтуу менен даярдалган болжол менен 0.001% жумушчу боёк. 2 mL ачыткы-глюкоза суспензиясын 2 mL жумушчу боёк менен аралаштырып, сыноо температурасына жеткириңиз, бир жолу 10 секунд чайкаңыз, таймерди иштетиңиз жана кайра чайкабаңыз. Чайкоо кычкылтекти кайра киргизип, пробирканы кайра көгөртөт; бул — процедурадан келип чыккан эң чоң бурмалоо. AQA даярдалган аралашма 35 Cде адатта болжол менен 5 мүнөттүн ичинде түссүздөнүшү керектигин белгилейт. Сыноолордогу орточо убакыттар 20 Cде 275 s, 35 Cде 128 s жана 45 Cде 145 s болгон. Булар жалпыга бирдей эталон эмес, бир тажрыйба түзүлүшүнөн алынган мисалдар. Көзөмөлдөнгөн шарттарда калыбына келүү ылдамдыгы менен метаболизмдик жактан активдүү ачыткынын ортосундагы сандык байланышты атайын калыбына келүү изилдөөлөрү, анын ичинде PMID 25773544 катары индекстелген иш жана Yeast (2014) журналындагы механизмди изилдөө колдойт.

Убакыт боюнча өзгөрүүнү көрсөтүү (атайын даярдалган материал)

Төмөнкү таблица жогоруда сүрөттөлгөн AQA үлгүсүндөгү тажрыйба түзүлүшүнүн негизинде атайын ушул макала үчүн даярдалган: 2 mL ачыткы-глюкоза аралашмасы жана болжол менен 0.001% болгон 2 mL жумушчу боёк, бир жолу 10 секунд чайкоо, андан соң козгобой инкубациялоо. Жазуулар студенттик топ колдонууга тийиш болгон форматтагы мисалдык көрсөткүчтөр; ылдамдык индекси 1ди секунд менен берилген түссүздөнүү убактысына бөлүү аркылуу аныкталат. Ушул эле пробиркалар менен тажрыйба жүргүзүп, бул жазууларды өлчөнгөн маанилерге алмаштырыңыз.

A, B жана C пробиркалары үчүн ылдамдык индексинин температурага көз карандылык графигин түзүңүз. Ийри сызык адегенде көтөрүлүп, андан соң түздөлөт же төмөндөйт; бул түз сызык эмес, ферменттер башкарган процесске мүнөздүү күтүлгөн көрүнүш. D, E жана F пробиркалары ошол ийри сызыктын маалымат чекиттери эмес. Алар — ийри сызыкты чечмелөөгө мүмкүнчүлүк берген контролдор.

Ар бир сыноонун маанилүүлүгүн камсыз кылган контролдор

Ар бир дем алуу сыноосуна үч кошумча үлгү керек. Кайнатылган же өлтүрүлгөн ачыткы, глюкоза жана боёк кошулган үлгү көк бойдон калышы керек; бул тез калыбына келүү тирүү клеткалардагы зат алмашууга көз каранды экенин далилдейт. Кошумча глюкозасыз тирүү ачыткы менен боёк — субстраттык контрол, бирок ачыткы өзүнүн ички запастарын сарптагандыктан, мында да жай түссүздөнүүнү күтүү керек. Ачыткысыз глюкоза менен боёк — химиялык бош үлгү. Ал зарыл, анткени щелочтуу чөйрөдөгү глюкоза клеткалар жок болсо да метилен көгүн калыбына келтире алат.

Жашоого жөндөмдүүлүктү саноо башкача контролду — процедуранын туруктуулугун талап кылат. Бирдей баштапкы боёк эритмеси, бирдей аралаштыруу катышы, бирдей боёо убактысы, бирдей камера аянты, бирдей бүчүр жана чек ара эрежелери; мүмкүн болсо, үлгүнүн кимге же кайсы шартка таандык экенин билбестен саноо керек. Эки оператордун жыйынтыгы он пунктка айырмаланганда, эсептөө барагы адатта себебин ачып берет: убакыттын айырмасы, көк түстү баалоо чегинин айырмасы же бүчүр эрежелеринин айырмасы. Боёлгон клеткаларды даярдоо жана кароо ыкмалары бактерияларды жөнөкөй боёо ыкмалары менен байланыштуу, ал эми боёк ар түрдүү үлгүлөрдө эмнени белгилерин кеңири баяндаган маалымат микроскоптук боёо атласында берилген. Көк түстүн кандай гана интенсивдүүлүгүн болбосун сандык баалоонун физикалык негиздери үчүн шарттары белгиленген жутулуу боюнча маалымдама ар бир коэффициент эмне үчүн өзүнүн эриткичи, pH жана концентрация шарттары менен кошо берилиши керектигин түшүндүрөт.

Сыноону суроого жараша тандаңыз. Азыр канча клетка тирүү экенин билүү — саноо маселеси; ага микроскоп жана эсептөө барагы менен жооп берилет. Бул культура канчалык активдүү дем алып жатканын билүү — кинетикалык маселе; ага секундомер жана көзөмөлдөнгөн пробиркалар менен жооп берилет. Метилен көгү экөөнө тең кызмат кылат, бирок эч качан бир эле пробиркада, бир эле учурда эмес.