EMB агарында E. coli жана башка колониялардын көрүнүшүн чечмелөө

Студент белгисиз үлгүнү эозин-метилен көгү агарына штрих ыкмасы менен себет, түнү бою инкубациялайт да, эртеси жашыл жылтырагы бар кара колониялар өскөн табакты көрөт. Дептерине «E. coli, ырасталды» деп жазат. Бул жазуу табактагы көрүнүш далилдей алгандан ашыкча тыянак чыгарат. Табак белгилүү шарттардагы өсүү жана ферменттөө фенотибин көрсөтөт. Түрдү аныктоо — өзүнчө далилдерди талап кылган өзүнчө тыянак.

Бул колдонмодо EMB агарынын натыйжалары чечмелөө милдети катары каралат. Анда негизги принцип түшүндүрүлүп, контролдор менен коштолгон иллюстрациялык табактардын атласы каралат жана окуу китебиндеги көрүнүш жаңылткан учурлар көрсөтүлөт.

Табактын негизиндеги принцип

EMB агары — селективдүү да, дифференциалдык да чөйрө. Эозин Y жана метилен көгү боёктору көптөгөн грам-оң организмдердин өсүшүн басаңдатат, ошондуктан чөйрө грам-терс организмдердин өсүшүнө ыңгайлуу. Ошол эле боёктор индикатор катары да кызмат кылат: организм чөйрөдөгү кантты ферменттеп, жергиликтүү деңгээлде жетиштүү кислота пайда кылганда, колония боёкту көп сиңирип, кочкул кызгылт көктөн көгүш карага чейинки түскө өтөт. Кислота интенсивдүү пайда болгондо, колониянын бетинде металлдай жашыл кубулма жылтырак байкалышы мүмкүн. Эозин-метилен көгү агары бар табактар боюнча ASM протоколунда селекция менен дифференциациянын ушул айкалышы сүрөттөлүп, окутуу үчүн эталондук сүрөттөр берилген.

Натыйжаны чечмелөөдөн мурун бир маанилүү нерсени текшериңиз: кайсы курам колдонулган? Эски Holt Harris Teague курамында лактоза менен сахароза бар, ал эми Levine EMB курамында лактоза гана бар. Serratia marcescens изоляттарынын көбү сыяктуу сахарозаны ферменттеп, лактозаны ферменттебеген организмдер бул эки вариантта ар башка көрүнүшү мүмкүн. EMB чөйрөлөрү боюнча өндүрүүчүнүн документинде бул курамдык айырма так көрсөтүлгөн. Натыйжа менен бирге өндүрүүчүнү жана чөйрөнүн курамын дептерге жазыңыз.

Даяр, бирок себиле элек EMB агары адатта кызыл күрөңдөн кызгылт кызгылт көккө чейинки түстө болот; кээде жашыл өң же майда чөкмө байкалат. Бул фондук түс өсүүнү билдирбейт. Ар бир натыйжаны себилбеген табак же документте көрсөтүлгөн баштапкы көрүнүш менен салыштырыңыз. Окутуу протоколунда башкача көрсөтүлбөсө, баштапкы табакты 35–37 C температурада аэробдук шартта болжол менен 18–24 саат инкубациялагандан кийин баалаңыз. Узак инкубация ферменттөөнүн көрүнүшүн өзгөртүшү мүмкүн.

Табакты кантип кароо керек

Жарыктын эки түрүн колдонуңуз. Адегенде табакты чагылган же кыйгач түшкөн жарыкта карап, кыйшайтыңыз: металлдай жылтырак кубулма болот жана кароо бурчуна жараша көрүнүп же жоголуп кетиши мүмкүн. Андан соң колониянын түсүн жана кара борборлорун баалоо үчүн табак аркылуу өткөн жарыкта караңыз. Жакшы бөлүнүп өскөн колонияларды тандаңыз, анткени жыш жайгашуу жана коңшу колониялар кислотанын жергиликтүү топтолушун өзгөртүп, түстү басаңдатып же күчөтүшү мүмкүн. ASM сүрөттөр топтому муну түздөн-түз көрсөтөт: аралаш культурадагы E. coli күтүлгөн жылтырагын жоготушу мүмкүн, себеби айланасындагы организмдер кычкыл чөйрөнү өзгөртөт.

Практикалык тапшырма мүмкүнчүлүк берсе, контролдорду кошуңуз. Окутууда көп колдонулган топтомго көгүш кара түс жана металлдай жылтырак фенотиби үчүн E. coli ATCC 25922, түссүз фенотип үчүн Salmonella Typhimurium ATCC 14028 же Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 сыяктуу ферменттебеген организм жана өсүүнүн басаңдашынын контролу катары Enterococcus faecalis же Staphylococcus aureus сыяктуу грам-оң организм кирет. Булар EMB чөйрөлөрү үчүн сапатты көзөмөлдөөнүн стандарттык таблицаларында көрсөтүлгөн. Эгер оң контролдо жылтырак болбосо, белгисиз үлгүдөн шектенүүдөн мурун инкубацияны, колониялардын жыштыгын же чөйрөнүн курамын текшериңиз.

Табактардын иллюстрациялык атласы

Төмөндөгү табактар — чыныгы культуралардын сүрөттөрү эмес, түзүлгөн иллюстрациялар. Алар белгилүү бир штаммдын так өңүн эмес, көңүл буруу керек болгон көрүнүштү көрсөтөт. Аларды ASM эталондук сүрөттөрү жана окуу лабораториясындагы чыныгы табактар менен салыштырыңыз.

Табак 1: EMB агарындагы Escherichia coli, лактозаны интенсивдүү ферменттөөчү организм

EMB агарындагы E. coli адатта кочкул кызгылт көктөн көгүш карага чейинки түстө болот; көбүнчө борбору карарып, кислотанын интенсивдүү пайда болушунан металлдай жашыл жылтырак чыгат. Студенттер издеген белгилүү көрүнүш — ушул жылтырак, бирок аны аныктоочу белги эмес, кошумча далил катары кабыл алыңыз. Жылтырактын күчү штаммга, инкубация убактысына, колониялардын тыгыздыгына жана кароо бурчуна жараша өзгөрөт. Жылтырактын жоктугу E. coli болушун жокко чыгарбайт, ал эми жылтырагы жок кара колония башка бир нече ферменттөөчү организмге да туура келет. Кийинки иштер үчүн жыш өскөн секторду баалоонун ордуна жакшы бөлүнүп өскөн колонияны тандаңыз.

Табак 2: EMB агарындагы Klebsiella pneumoniae, былжырлуу колония түзүүчү ферменттөөчү организм

EMB агарындагы Klebsiella pneumoniae адатта кызгылт кызгылт көктөн күрөң кызгылт көккө чейинки өңдөгү ири, жалтырак, былжырлуу колонияларды түзөт. Алардын борбору көбүнчө кара болот, бирок адатта күчтүү металлдай жылтырак болбойт. Ушундай морфология Enterobacter сыяктуу тектеш ферменттөөчү организмдерде да кездешет. Былжырлуу текстура жана колониянын өлчөмү да баалоонун бир бөлүгү: кичине жана жалпак кызгылт колониянын чечмелөөдөгү мааниси ири, күмбөз сымал былжырлуу колонияныкынан айырмаланат. E. coli сыяктуу эле, табак ферменттөө фенотибин гана болжолдоого мүмкүндүк берет, ал эми түр деңгээлинде аталыш берүү үчүн төмөндө сүрөттөлгөн биохимиялык ырастоо керек.

Табак 3: EMB агарындагы Salmonella жана башка ферменттебеген организмдер, түссүз колониялар

EMB агарындагы Salmonella жана лактозаны ферменттебеген тектеш организмдер, анын ичинде Shigella жана көптөгөн Pseudomonas изоляттары, адатта түссүз, жарым тунук же ачык янтарь түстөгү колониялар түрүндө өсөт. Айрым курамдарда жана шарттарда бир аз кызгылт өң пайда болот, ошондуктан ачык кызгылт колонияны дароо ферменттөөчү организм деп эсептөөгө болбойт. EMB Salmonella менен Shigellaны же башка ферменттебеген организмдерди айырмалабайт; мындай айырмалоо кийинки тесттердин милдети. Ошондой эле E. coli колонияларына окшош металлдай жылтыраган колонияларды түзгөн лактоза-оң Salmonella штаммдары катталганын эске алыңыз. Бул да бир табак менен эле акыркы тыянак чыгарууга болбой турганынын дагы бир себеби.

Табак 4: Serratia marcescens жана чөйрөнүн курамынан келип чыккан жаңылыштык

Serratia marcescens өзүнчө бөлүмгө татыктуу, анткени студенттер көбүнчө кызыл колонияларды күтүп, андан кийин табактагы көрүнүштү туура эмес чечмелешет. Клиникалык изоляттардын көбү лактозаны ферменттебейт, ошондуктан Levine EMB чөйрөсүндө алар көбүнчө ачык же начар боёлгон болуп көрүнөт. Көптөгөн изоляттар сахарозаны ферменттегендиктен, курамында сахароза бар чөйрөдө реакция кочкулураак же кислота пайда болушуна көбүрөөк байланышкан болушу мүмкүн. 35–37 C температурада кадимки кызыл продигиозин пигментин да күтпөңүз; инкубатор температурасында пигменттин пайда болушу туруктуу эмес. Протоколдо EMB агарындагы Serratia marcescens жөнүндө айтылса, ал билдирүү кайсы курамга таянарын текшериңиз. Serratia метаболизми боюнча серепте бул жаңылыштыктын негизиндеги лактоза-терс жана сахароза боюнча өзгөрмө көрүнүш жалпыланган.

Табак 5: контролдор жана өсүшү басаңдатылган организмдер

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus жана Bacillus сыяктуу грам-оң организмдердин өсүшү EMB агарында адатта токтотулат же кыйла басаңдатылат, бирок бул бардык штаммдар үчүн толук тоскоолдук эмес. Контролдор топтому баалоонун негиздүүлүгүн камсыз кылат: E. coli контролунда көгүш кара түстүү, жылтырагы бар жакшы өсүү, ферменттебеген организмдин контролунда түссүз өсүү, ал эми өсүүнү басаңдатуу контролунда өтө аз өсүү же такыр өсүү жок болушу керек. Эгер өсүүнү басаңдатуу контролу жакшы өссө, селективдүү баскыч иштеген эмес жана ошол партиядагы калган бардык натыйжалар күмөндүү болот. Боёо ыкмалары культуралык чөйрөлөрдөн башка суроого жооп берет; лабораторияда предметтик айнектеги препараттарды боёо боюнча метилен көгү менен боёо атласын караңыз.

Чектери көрсөтүлгөн салыштыруу

Жаңылтуучу көрүнүштөрдү үч сүйлөм менен жыйынтыктоого болот. Кара түс E. coli дегенди билдирбейт, анткени Klebsiella, Enterobacter жана башка ферменттөөчү организмдер жылтырагы жок кара борборлорду түзөт. Кызгылт түс Klebsiella дегенди билдирбейт, анткени орточо же жай ферменттөөчү организмдер жана ферменттебейт деп эсептелген айрым организмдер кызгылт же ачык кызгылт көк болуп көрүнөт. Жылтырак E. coli толук аныкталды дегенди билдирбейт, анткени башка интенсивдүү ферменттөөчү организмдер да аны пайда кыла алат. Окутуу протоколу жана андагы аралаш культуралардын сүрөттөрү бул жаңылыштыктардын ар бирин көрсөтөт.

Ырастоонун чектери

EMB агары түрдү эмес, фенотипти көрсөтөт. Ар башка организмдердин колониялары бирдей көрүнүштө болушу мүмкүн, ал эми бир организм штаммга, жашына, жыш жайгашуусуна, чөйрөнүн курамына жана инкубацияга жараша окуу китебинде сүрөттөлгөн көрүнүштөн айырмаланышы мүмкүн. Ошондуктан окуу жана клиникалык иш тартиптеринде EMB морфологиясы алдын ала божомол катары каралат.

Студент үчүн негиздүү иш тартиби мындай: бөлүнүп өскөн колонияны сүрөттөө (өлчөмү, түсү, борбору, кыйгач жарыктагы жылтырагы, былжырлуу мүнөзү), чөйрөнүн курамын, инкубациянын убактысын жана температурасын, контролдорду жазуу; андан кийин кандайдыр бир ырастоочу тестке чейин жакшы бөлүнүп өскөн колонияны кайра өстүрүп, таза культура алуу. Кийинки кеңири колдонулган кадамдарга E. coli жана колиформаларды алдын ала аныктоо үчүн Грам боюнча боёо менен IMViC реакциялары, ичеги организмдери үчүн TSI же KIA жана организмге мүнөздүү биохимиялык тесттердин топтомдору кирет. Тапшырма талап кылса, серологиялык, MALDI TOF же башка валидацияланган аныктоо ыкмалары колдонулат. EMB чөйрөсүнүн ичеги организмдери үчүн селективдүү жана дифференциалдык чөйрөлөрдүн арасындагы орду тууралуу жалпы маалымат үчүн ичеги организмдерин өстүрүүчү чөйрөлөргө киришүү материалдарын жана Грам боюнча боёодон кийинки текшерүүнү караңыз. Предметтик айнектеги көк боёк эмнени далилдей алары жана эмнени далилдей албасы тууралуу тектеш суроодо метилен көгү менен боёо атласы да байкоону тыянактан ушул эле принцип менен бөлөт.

Тыянактан мурун байкоону жазыңыз. «Levine EMB чөйрөсүндө 24 сааттан кийин кароо бурчуна жараша өзгөргөн жашыл жылтырагы бар кочкул көгүш кара колониялар байкалды; бул лактозанын интенсивдүү ферменттелишине шайкеш келет» — негиздүү жазуу. «E. coli, ырасталды» деген жазуу табактын өзү гана камсыз кыла албаган ырастоо баскычын талап кылат.