Ma şîna metîlenê dikare ji derveyî Kompleksa III ya mîtokondriyê derbas bibe? Çima lêkolîn li hev nakin

Du laboratûvaran pirs kir ka şîna metîlenê dikare ji derveyî Kompleksa III ya mîtokondriyê ya astengkirî derbas bibe. Yekê bersiva na da. Ya din bersiva erê da. Her du jî xwedî daneyên ceribandinê bûn.

Lêkolîna yekem, li ser mîtokondriyên mêjiyê mişkan, dît ku rengker nikare vê bike. Ya duyem, li ser mîtokondriyên mêjiyê sê cureyên rovikan, dît ku ew dikare qismekî vê bike. Lêkolîneke sêyem, li ser kezeba mişkan, gelek caran di heman çarçoveyê de tê binavkirin, lê tiştekî din ceriband. Heke wê di cihê xwe de bihêlin, nîvê tevliheviyê radibe.

Li vir mekanîzmayeke gerdûnî tune ku bê ragihandin. Sê ceribandin hene ku astengker, doz û pîvanên wan cuda ne. Pêşî mercan bixwînin. Encam li dû wan tên.

Li vir derbasbûna ji derveyî astengiyê tê çi wateyê

Elektron bi rêya Kompleksa I (ji NADH) an Kompleksa II (ji suksînatê) dikevin zincîrê, di Kompleksa III re derbasî sîtokroma c dibin, paşê di Kompleksa IV re digihîjin oksîjenê. Şaneyê gradyenta ku li vê rêyê ava dibe ji bo çêkirina ATP bi kar tîne.

Îdiaya derbasbûna ji derveyî astengiyê dibêje ku şîna metîlenê elektronan berî cihê astengiyê digire û piştî wê radest dike. Rengkera oksîdkirî elektronan ji NADH an pêkhateyên destpêka zincîrê digire û dibe leukometîlen şîn; forma reduksiyonkirî jî wan dide sîtokroma c an dîsa vedigerîne zincîrê. Heke ev radestkirin piştî cihê astengiyê pêk bê, hilmstandin û potansiyela membranê qismekî vedigerin. Heke li cihê astengiyê an berî wê pêk bê, tiştek venagere.

Hûrgiliyeke Kompleksa III beşeke mezin ji vê nakokiyê diyar dike. Ev kompleks çerxa Q bi du cihên girêdana astengkeran dimeşîne. Antîmîsîn bi cihê Qi ve girê dibe. Mîksotîazol bi cihê Qo ve girê dibe. Lêkolîna ku tenê yek ji wan bi kar tîne tenê nîvê kompleksê ceribandiye.

Lêkolîna yekem: li mîtokondriyên mêjiyê mişkan derbasbûna ji derveyî astengiyê tune

Gureev û hevkarên wî mîtokondriyên korteksa mişkên C57BL/6 bi kar anîn, bi dîgîtonînê veqetandin û bi 0.1 mg proteîn ji bo her ml pîvan kirin. Substrat di sê rêjîman de bûn: pîrûvat bi malatê re, her yek 5 mM; suksînat bi 10 mM bi glutamatê ya 2 mM re; û L-prolîn bi 10 mM. Astengker rotenon bi 1 micromolar (Kompleksa I) û antîmîsîn bi 1 microgram ji bo her ml (Kompleksa III) bûn. Dozên rengkerê 0.5, 1 û 2 micromolar bûn; 1 micromolar wekî konsantrasyona sereke hat bikaranîn. Rêbaz û şopên pîvanan di ragihandina FEBS Letters de ne.

Derbasbûna ji derveyî Kompleksa I kar kir. Rotenon hilmstandina bi ADP teşwîqkirî ji nêzî 121 daxist nêzî 2 nmol di her deqeyê de ji bo her mg, û rengkera 1 micromolar ew vegerand nêzî 21. Potansiyela membranê bi pîrûvat û malatê û bi L-prolînê vegeriya.

Derbasbûna ji derveyî Kompleksa III kar nekir. Antîmîsîn hilmstandin daxist nêzî 16, û rengkerê ew tenê gihand nêzî 20. Bi tu substratê, heta dozên rengkerê yên 5 micromolar, potansiyela membranê venegeriya. Daneyên peroksîdê jî heman tişt nîşan dan: rengkerê bi tena serê xwe derdana peroksîdê ji rêjeya bingehîn a nêzî 76 pmol di her deqeyê de ji bo her mg, li sê dozan, gihand nêzî 1170, 1460 û 1945; lê antîmîsîn ev sînyala ku rengkerê çêkiribû bi rêzê nêzî ji sedî 25, 88 û 96 kêm kir. Heke rengkera reduksiyonkirî rasterast bi oksîjenê re reaksiyon bikira, astengkirina Kompleksa III nedivê sînyalê bitepisînda. Nivîskaran encam derxist ku rengkera reduksiyonkirî li cihê Qo ya Kompleksa III, berî cihê astengiya antîmîsînê, tê oksîdkirin. Bi gotinan, çerxa kurt ev e: ji bexşkeran bo rengkerê, ji rengkerê bo Qo, paşê bi rêya asayî ber bi pêş ve. Ji derveyî astengiya rotenonê derbas dibe. Ji ya antîmîsînê derbas nabe.

Lêkolîna duyem: derbasbûna qismî li sê cureyan, li her du cihên astengkeran

Svab û hevkarên wî sêwirana ceribandinê firehtir kirin. Mîtokondriyên mêjiyê mişkan, ratan û berazên Gîneyê bi Percoll veqetandin û bi heman 0.1 mg ji bo her ml pîvan kirin, bi pîrûvat û malatê an glutamat û malatê, her yek 5 mM. Wan du astengkerên Kompleksa III bi kar anîn: antîmîsîn A bi 0.3 micromolar û mîksotîazol bi 1 micromolar. Rengker di piraniya pîvanan de 2 micromolar bû, di xebata sîtokroma c de 0.5. Her sê cure, bi protokolên hevaheng, di gotara bi gihîştina vekirî de ne.

Li her sê cureyan, ji derveyî her du astengiyan qismekî derbasbûn çêbû. Di mîtokondriyên mişkan de, antîmîsîn hilmstandin tepisand û rengkerê ew nêzî ji sedî 60 zêde kir, ji nêzî 37 ber bi 59 nmol di her deqeyê de ji bo her mg. Mîksotîazol ew ji sedî 88 tepisand û daxist nêzî 4.5; rengkerê jî ew pênc qat zêde kir û gihand nêzî 23. Di bin bandora her yek ji astengkeran de, potansiyela membranê qismekî dîsa polarîze bû. Ji bo dûrxistina artefaktên optîkî, ew bi du rengkeran (safranîn O û TMRM ya rêjeyî) hat pîvan.

Vê gotarê radestkirina elektronan jî rasterast ceriband, tiştek ku lêkolîna yekem qet nekiribû. Sîtokroma c ya asetîlkirî ya ji derve, bi 25 micromolar, ji aliyê mîtokondriyên enerjîdar ve, bi astengkeran an bê wan, nehat reduksiyonkirin; lê zêdekirina rengkerê di her du rewşan de reduksiyon pêk anî. Di tampona bê şane de, NADH bi rengkerê re sîtokroma c bi rêjeyeke li gorî NADH reduksiyon kir. Bi gotinan, derbasbûna dirêjtir ev e: ekîvalentên reduksiyonê bo rengkerê, rengker rasterast bo sîtokroma c, Kompleksa IV bo oksîjenê. Ev rê bi tevahî Kompleksa III derbas dike, ji ber vê yekê derbasbûna ji derveyî her du astengkeran gengaz e.

Du pîvanên din piştgirî didin vê şîroveyê. Dema rengker li mîtokondriyên bi mîksotîazolê dermankirî hat zêdekirin, floresansa NAD(P)H kêm bû; ev tê wê wateyê ku ekîvalentên reduksiyonê bi rêya nû diherikîn. Herwiha, absorbansa rengkerê li 660 nm her zêdekirinê bi rêzê şopand, û şilava serîn a piştî santrîfûjê nîşan da ku rengkera oksîdkirî di hundirê mîtokondriyên enerjîdar de zêdetirî sed qat kom dibû, paşê dema potansiyel hilweşiya ji wan derdiket. Hesabê protonan jî li vê yekê tê: derbaskirina gavên pompekirinê ji bo her cotê elektronan li şûna 10 tenê nêzî 2 protonan dihêle. Ji ber vê yekê, bikaranîna bileztir a oksîjenê bi tenê repolarîzasyona qismî re nîşana derbasbûneke rastîn a ji derveyî astengiyê ye, ne delîleke li dijî wê.

Heman amadekirinê bersivên ku bi xwendina lezgîn şaş tên şîrovekirin jî çêkirin. Dema astengker û rengker bi hev re bûn, ADP li şûna zêdekirina hilmstandinê wê kêm kir, û astengkirina veguhastinê li şûna hêdîkirinê wê teşwîq kir; di heman demê de potansiyela membranê hîn jî di aliyên asayî de guherî. Di vê pergalê de tenê xerckirina oksîjenê dikare mirov şaş bike.

Lêkolîna sêyem: lêkolîna kezebê ku Kompleksên I û II ceriband, ne III

Lee û Boelsterli mîtokondriyên kezeba mişkan û hepatosîtên di çandê de mezinbûyî bi kar anîn, ku bi efavîrenzê (Kompleksa I, IC50 nêzî 30 micromolar) û hîdrazînê, metabolîta îsonîazîdê (Kompleksa II, IC50 nêzî 30 micromolar), zirar dîtibûn. Rengker bi nêzî 30 micromolar oksîdasyona NADH, potansiyela membranê û ATP vegerand, di heman demê de oksîdant û mirina nekrotîk kêm kir. Gotara Redox Biology vê bi modela ku rengker elektronan ji derveyî Kompleksên I û II yên zirardîtî digihîne rave dike.

Ev encam li ser beşa berê ya zincîrê çarçoveyeke pejirandî dide, û li ser Kompleksa III tiştek nabêje, ji ber ku di wê de li wir tiştek nehatibû astengkirin. Ew nikare tu yek ji her du lêkolînên mêjiyê piştrast bike an red bike.

Matrîsa mercan

Çar sedem ku her du lêkolînên Kompleksa III dikarin di derbarê sazkirina xwe de rast bin

1. Astengker ne heman destwerdan bû. Antîmîsîn bi tena serê xwe bi 1 microgram ji bo her ml, li hember antîmîsîna 0.3 micromolar û astengkereke cuda ya cihê Qo. Rêya rengkerê ya ku elektronan dide cihê Qo tam li cihê ku rêya rasterast a ber bi sîtokroma c bi ser dikeve, têk diçe. Yek cih nikare nûnerê her duyan be.

2. Doza rengkerê û dem cuda bûn. Konsantrasyonên sereke 1 li hember 2 micromolar bûn, ji bo madeyeke ku di çerxa redoksê de digere û ku girtina wê û reduksiyona rasterast a sîtokroma c ji aliyê wê ve bi konsantrasyon û demê ve girêdayî ne. Cudahiyên biçûk ên dozê tevî demên cuda yên pîvanê dikarin beşên cuda yên heman torê eşkere bikin.

3. Amadekirin cuda bûn. Veqetandina bi dîgîtonînê li hember veqetandina bi gradyenta Percoll civakên mîtokondriyî yên hevpar lê ne yekreng hilbijêre. Konsantrasyona proteînê di her duyan de 0.1 mg ji bo her ml bû, lewma ew guhêrbar ji berhevdanê derdikeve; lê bincivak û yekparebûn namînin wek hev. Gumana cudahiya cureyan jî hat rakirin: koma duyem heman fenotîp di mişkan de jî dubare kir.

4. Rewşa substratê diyar dike ka rengker çi dikare bike. Sê rêjîmên substratê li hember cotên girêdayî NADH. Dabînkirina NADH û potansiyela membranê bi hev re diyar dikin ka rengker çiqas zû tê reduksiyonkirin û li ku belav dibe. Rêyeke ku rengkera reduksiyonkirî li kêleka sîtokroma c ya oksîdkirî dixwaze, bi vê hilbijartinê ve girêdayî ye.

Îdiaya din a derbasbûna ji derveyî astengiyê çawa bê xwendin

Bipirsin kîjan kompleks hatiye astengkirin, bi kîjan astengkerê, li kîjan cihî û bi kîjan dozê. Li konsantrasyona rengkerê û dema pîvanê bipirsin. Li tevn, cure, veqetandin, konsantrasyona proteînê û substratê bipirsin. Herwiha bipirsin ka potansiyel, hilmstandin, rewşa redoksê û ceribandineke radestkirina rasterast bi hev re li hev tên an na, ji ber ku li vir tenê xerckirina oksîjenê zêdetirî carekê aliyê şaş nîşan da.

Kurteya sînorkirî hîn rast e. Derbasbûna rengkerê ji derveyî Kompleksa I hatiye pejirandin. Li derdora Kompleksa III, mîtokondriyên mişkan bi antîmîsîna 1 microgram ji bo her ml û rengkera 1 micromolar derbasbûneke fonksiyonel a ji derveyî astengiyê nîşan nadin. Lê sê cure bi antîmîsîna 0.3 micromolar an mîksotîazola 1 micromolar û rengkera 2 micromolar, derbasbûna qismî bi veguhastina rasterast ji rengkerê bo sîtokroma c nîşan didin. Ev hevok dikarin bi hev re rast bin. Her encameke firehtir derxistina encamê ji derveyî sînorên daneyan e.

Xwendina têkildar îdiaya nîqaşkirî di çarçoveya kîmyaya bê nakokî de dihêle: şîna metîlenê çawa elektronan diguhêze ji bo veguhastina zincîrî, ceribandinên derbasbûna ji derveyî Kompleksa I ji bo rewşa pejirandî ya beşa berê ya zincîrê, pîvanên potansiyela membranê û artefaktên wan ji bo sedema hewcehiya du rengkeran, û karanîna madeyên çerxa redoksê di laboratûvarê de ji bo xefikên doz û demê.