Gotar
Alternatîvên şîna metîlenê ji bo mîkroskopiyê: li gorî kar hilbijêrin
Ji bo smear-ek bakterî ya hêsan, dema armanc dîtina şiklê hucreyan be, crystal violet dikare li şûna şîna metîlenê were bikaranîn. Ji bo hucreyên sax, alternatîva çêtir dikare phase contrast be bêyî ku tu boyax were bikaranîn. Hilbijartin bi çavdêriya ku divê bikin ve girêdayî ye.
Bifikirin du kes heman kultura bakteriyan dinêrin. Yek dixwaze batangiyan ji hucreyên girover cuda bike. Yê din dixwaze bizane gelo dermankirinê bakterî kuştine an na. Boyaxek ku ji kesê yekem re wêneyek zelal dide, dibe ku ji kesê duyem re tu bersiva bikêrhatî nede.
Berî hilbijartina cîgirê, vê hevokê temam bikin: “Divê ez ___ di ___ de çavdêrî bikim, û divê / ne pêdivî ye ku hucre sax bimînin.” Ev hevok karê ku boyax divê bike diyar dike.
Bi nimûne û pirsê dest pê bikin
Pêşî biryar bidin gelo divê hucre sax bimînin an na, paşê taybetmendiya ku divê çavdêrî bikin destnîşan bikin:
- Divê hucre sax bimînin: ji bo tevger an şiklê, phase contrast an DIC ya bêboyax bifikirin; ji bo DNA ya navokî, Hoechst 33342 bi floresansê bifikirin; ji bo yekparebûna membranê, assayek pejirandî wek SYTO 9 bi propidium iodide hilbijêrin.
- Ne pêdivî ye ku hucre sax bimînin: ji bo morfolojiya bakteriyan, boyaxa hêsan a crystal violet an boyaxa neyînî ya nigrosin bifikirin; ji bo reaksiyona Gram, rêbaza temam a Gram-stain bikar bînin; ji bo DNA ya navokî di hucreyên sabîtkirî de, floresansa DAPI bifikirin.
Vê tabloyê bikar bînin da ku sînordariyên her şaxê berawird bikin. Ev hilbijartinên rêbazê ne, ne rêwerzên guherandina şûşeyan di protokolek heyî de.
| Tiştê ku divê çavdêrî bikin | Nimûne û alav | Alternatîva namzed | Sînordariya sereke |
|---|---|---|---|
| Şikl û rêzkirina bakteriyan | Smear-a bakterî ya amadekirî; brightfield | Boyaxa hêsan a crystal violet | Morfolojiyê nîşan dide; reaksiyona Gram an saxmayînê tesbît nake. |
| Xetên derveyî yên hucreyan li ser paşxaneyek tarî | Amadekariya bakteriyolojîk; brightfield | Boyaxa neyînî ya nigrosin | Amadekirin û formulasyon girîng in; hucreyek bêboyax ne şert e ku sax be. |
| Reaksiyona Gram | Smear-a bakterî ya amadekirî; brightfield | Rêbaza temam a Gram-stain | Pêdivî bi rêza temam a reagentan û kontrolan heye. |
| Tevger an guhertin di hucreyên sax de | Amadekariya şil a lihevhatî; phase contrast an DIC | Tu boyax tune | Pêdivî bi optîka guncaw heye; kontrast molekulek nasnake. |
| DNA ya navokî | Hucreyên sabîtkirî; floresans | DAPI | Pêdivî bi fîlterên excitation û emission yên lihevhatî heye. |
| DNA ya navokî di hucreyên sax de | Hucreyên sax; floresans | Hoechst 33342 | Ketina nav hucreyê nîşan nade ku şertên wênekêşiyê bêzirar in. |
| Yekparebûna membrana bakteriyan | Bakteriyên nesabîtkirî; floresans | SYTO 9 bi propidium iodide | Boyaxkirina membranê pîvanek neyekser a saxmayînê ye. |
Ji bo smear-ek hêsan, rêbazê bi baldarî biguherînin
Dema kar dîtina yekreng a morfolojiya bakteriyan be, crystal violet namzedek pratîk e. Bacteriological Analytical Manual ya FDA du formulasyonên crystal violet yên ji bo boyaxkirina hêsan guncaw rêz dike. Formulasyonek belgekirî û rêbaza amadekirina wê bikar bînin; tenê navê boyaxê reagentek karî diyar nake.
Crystal violet di Gram staining de jî tê bikaranîn, lê ev nayê wê wateyê ku boyaxa hêsan a crystal violet Gram stain e. Di protokola ASM ya Gram-stain de, encama cudaker bi crystal violet, iodine, decolorization û counterstaining ku bi rêzê kar dikin ve girêdayî ye. Derxistina van gavan tiştê ku wêne dikare tesbît bike diguherîne. Ji bo vê cudahiyê binêrin boyaxkirina hêsan li hember Gram staining.
Nigrosin rêyek cuda pêşkêş dike ji bo eşkerekirina xetên derveyî: paşxaneyê tarî dike, dema ku hucreyên bakteriyan bi nisbet sivik dimînin. Di rêwerzên nigrosin yên Merck de hûrguliyek bikêrhatî heye ku lîsteyek giştî ya cîgiran dibe ku ji dest bide. Formulasyona karî ya diyar kirî formaldehyde dihewîne. Ji ber vê yekê, hûn nikarin tenê ji peyvên “boyaxa neyînî” encam bigirin ku ew bi hucreyên sax re lihevhatî ye, herçend hucre bixwe bêboyax xuya bikin. Formulasyona temam û amadekirina nimûneyê kontrol bikin.
Ji bo nimûneyên sax, guhertina optîkê bifikirin
Heke hûn dixwazin tevger an dabeşbûna hucreyan temaşe bikin, zêdekirina boyaxek din dibe ku çavdêriyê aloztir bike. Wek Nikon di rêberê xwe yê kontrastê di nimûneyên transparan de rave dike, phase contrast û differential interference contrast, an DIC, bi cudahiyên taybetmendiyên optîkî yên nimûneyan wan xuya dikin. Ew dikarin hucreyên sax û bêboyax nîşan bidin, bi şertê ku mîkroskop komponentên pêwîst hebin.
Ev hilbijartin amadekariyek bêboyax diparêze, lê agahdariya berdest diguherîne. Hûn dikarin sînorek an tevgerek bişopînin bêyî ku bizanin kîjan molekul kontrast afirandiye. Heke pirs li ser cihê molekulî be, li şûna wê rêbazek guncaw a labeling hilbijêrin.
Ji bo DNA ya navokî, berawirdkirina DAPI û boyaxên Hoechst ya Invitrogen bikaranîna berbelav a DAPI bi hucreyên sabîtkirî ji Hoechst 33342 ya ku zêdetir dikare bikeve hucreyê û ji bo labeling ya hucreyên sax tê tercîh kirin cuda dike. Herdu jî pêdivî bi alavên floresansê hene. Tu yek ji wan cîgirek rasterast ji bo boyaxek rengîn a brightfield nîne.
Temasa bi boyaxê û ronahîkirinê wek şertên ezmûnî bihesibînin. Dema tevgera hucreyan pîvana we ye, amadekariyên boyaxkirî û bêboyax berawird bikin.
Hucreyek sor bi xwe ne hucreyek mirî ye
SYTO 9 û propidium iodide gelek caran bi hev re têne bikaranîn ji bo nirxandina yekparebûna membrana bakteriyan. Rêbera BacLight membranên yekpare bi boyaxkirina kesk û membranên zirardîtî bi boyaxkirina sor ve girêdide. Ev şîrove ji bo nimûneyê pêdivî bi pejirandinê heye.
Lêkolînek 2019 ya Rosenberg û hevkarên wî pirsgirêkê nîşan dide. Di biofilmên 24-hour E. coli li ser camê di phosphate-buffered saline de, about 96% ji hucreyan in situ wek propidium-iodide-positive xuya kirin. Lê nivîskar texmîn kirin ku piştî berhevkirinê 82% dikarin werin çandin. Wêneyên confocal hucreyên bi hundirê kesk di bin materyala sor-boyaxkirî de nîşan dan, ku nucleic acidên extracellular wek sedema îşareta şaşdar nîşan didan.
Van sedeyan pîvanên cuda yên li ser amadekariyên lêkolînê rave dikin, ne faktorek sererastkirinê ya gerdûnî. Dersê bikêrhatî ev e ku kontrol bikin ka îşaretê çi afirandiye. Di biofilmekê de, boyaxek nucleic-acid dikare hem materyala li derveyî hucreyan hem jî ya hundirê hucreyên zirardîtî destnîşan bike. Ji bo encamek li ser saxmayînê, lêkolîner pîvanên temamker, wek cultivation an metabolic activity, pêşniyar dikin, di heman demê de qebûl dikin ku her yek sînordariyên xwe hene.
Kontrol bikin ku alternatîv bi rastî çi dihewîne
Rêbazek alternatîv a boyaxkirinê dibe ku hîn jî şîna metîlenê dihewîne. Giemsa mînakek e: Merck hilbera xwe wek çareseriya azure-eosin-methylene-blue rave dike, ku ji bo karanînên di nav de smearên xwîn û bone-marrow tê armanc kirin. Ew dikare ji bo nimûneyek cuda rêbazek cuda be, lê hewcedariya derxistina şîna metîlenê pêk nayîne.
Heke derxistina compoundekê beşek ji ezmûnê ye, berî berawirdkirina wêneyan nasname û formulasyona reagentê kontrol bikin. Rêbera methyl blue, methylene blue û boyaxên bi navên nêzîk cudahiyên navlêdanê rave dike.
Berî bikaranîna encamê cîgirkirinê piştrast bikin
Ji bo rêbazek nû, bi nimûneyên temsîlker û kontrolek guncaw berawirdkirinek piçûk bikin. Li ku derfet hebe, mîhengên mîkroskopê berawirdbar bihêlin. Formulasyona reagentê, amadekirina nimûneyê, exposure û şertên wênekêşiyê tomar bikin da ku wêneyek ku çêtir xuya dike were lêkolîn kirin, ne ku tenê were tercîh kirin.
Serkeftinê li gorî pirsa destpêkê binirxînin. Ji bo morfolojiyê, binirxînin ka sînor û rêzkirina hucreyan hîn jî dikarin werin şîrove kirin. Ji bo labeling ya navokî, cihê îşaretê û paşxaneyê binirxînin. Ji bo saxmayînê, ji dabeşkirina rengên balkêş zêdetir delîl bixwazin. Rêbera berfirehtir a boyaxkirina şîna metîlenê û karanînên laboratûwarî rave dike ka çavdêrî û amadekirin çawa bi hev re têne.
Alternatîva ku pîvana pêwîst a we diparêze hilbijêrin. Reng tenê yek ji taybetmendiyên wêneya encamê ye.