메틸렌 블루와 산화질소: NOS, cGMP, 혈관 신호전달

질문은 단순해 보인다. 메틸렌 블루는 산화질소를 억제할까? 실험실에서는 이 질문이 서로 다른 네 가지 질문으로 나뉘며, 각각을 검증하는 실험도 다르다. 이들을 혼동하는 것이 메틸렌 블루와 산화질소에 관한 글이 확신에 차 있으면서도 모호하게 읽히는 주된 이유다.

산화질소 신호를 네 개의 고리로 이루어진 사슬이라고 생각해 보자. 유전자가 전사되어 산화질소 합성효소가 만들어진다. 이 효소는 아르기닌을 산화질소로 전환한다. 산화질소 기체는 다른 물질과 반응하기 전에 표적까지 확산한다. 가용성 구아닐산 고리화효소가 이를 감지하고 고리형 GMP를 만든다. 메틸렌 블루가 각 고리에 영향을 미친다는 연구 결과가 발표되어 있지만, 근거는 서로 다른 실험계, 농도, 동형효소에서 나온다. 한 고리에서 얻은 결과가 다른 고리에서의 작용을 입증하지는 않는다.

표준적인 신호전달 사슬을 쉽게 설명하면

혈관벽에서 표준적인 과정은 다음과 같다. 자극이 내피세포에 작용한다. eNOS 또는 NOS3라고 부르는 내피 산화질소 합성효소가 짧고 소량의 산화질소를 생성한다. 이 기체는 인접한 평활근세포로 확산하고, 가용성 구아닐산 고리화효소의 환원된 철 헴에 결합하여 GTP가 고리형 GMP로 전환되는 속도를 높인다. 고리형 GMP가 단백질 인산화효소 G를 활성화하고, 칼슘 조절 방식이 바뀌면서 근육이 이완한다.

이와 구분해야 할 두 번째 사슬도 있다. 감염이나 사이토카인 노출 중에는 세포가 다른 효소인 유도성 산화질소 합성효소, 즉 iNOS를 전사한다. 이 효소는 NOS2라고도 한다. iNOS는 eNOS보다 더 많은 산화질소를 더 오래 생성한다. 세 번째 동형효소인 신경형 NOS, 즉 nNOS는 또 다른 맥락에 속한다. 논문에서 동형효소를 명시하지 않고 산화질소 합성효소라고만 하면, 잠시 멈추고 어떤 동형효소를 측정했는지 확인해야 한다. 메틸렌 블루가 전자를 이동시키는 방식에 대한 개요에서도 산화환원 표적 전반에 대해 같은 점을 강조한다. 전달 과정 자체만으로는 아무 일도 일어나지 않으며, 양쪽 끝의 반응 상대가 결과를 결정한다.

측정된 고리형 GMP 역시 직접적인 효소 분석이 아니라 여러 과정이 통합된 지표다. 그 수준은 고리화효소에 의한 합성량에서 포스포디에스테라아제에 의한 분해량을 뺀 결과를 반영하며, 혈관 평활근에서는 특히 PDE5가 중요하다. 따라서 고리형 GMP가 감소했다는 것은 감지기에 도달한 신호가 줄었다는 뜻이다. 그것만으로 어느 고리에 문제가 생겼는지는 알 수 없다.

고리 1: iNOS 효소가 덜 만들어진다

세균성 지질다당류, 인터페론 감마 또는 둘 모두로 자극한 생쥐 대식세포의 대식세포 전사 실험에서, 메틸렌 블루는 예상되는 iNOS 단백질 증가를 막고 iNOS 전령 RNA를 강하게 억제했다. 중요한 단서는 변하지 않은 부분에 있다. 억제인자 I 카파 B 알파의 분해, NF 카파 B와 STAT1의 인산화, 이들 인자의 핵 내 이동은 대체로 유지되었다. 감소한 것은 이들의 DNA 결합이었다. 염색질 면역침강 분석에서도 iNOS 프로모터에서 이들 인자가 차지하는 비율이 감소한 것으로 확인되었다.

이는 효소량 변화보다 상위 단계에서 일어나는 유전자 조절 효과이지, 이미 존재하는 효소를 즉각적으로 차단하는 작용이 아니다. 단백질이 생성되기 전에 전사인자가 프로모터에 결합해야 하는 염증성 신호전달에 해당한다. 이 결과는 안정 상태의 혈관에서 상시 발현되는 eNOS에 대해 직접적으로 말해 주는 바가 없으므로, 설명할 때도 그 범위를 지켜야 한다.

고리 2: 이미 존재하는 NOS 효소의 작동이 느려진다

쥐를 대상으로 한 연구에서는 다른 단계를 검증했다. 시상하부 NOS 활성 연구에서 의식이 있는 수컷 쥐에게 지질다당류를 정맥 투여한 뒤, 세 시간 후 생리식염수 또는 3 mg per kg의 메틸렌 블루를 정맥 투여했다. 이후 표지된 아르기닌이 시트룰린으로 전환되는 정도를 측정하여 시상하부 내측 기저부의 산화질소 합성효소 활성을 평가했다. 스트레스와 생리식염수만으로도 일부 칼슘 비의존성 활성이 유도되었으며, 지질다당류는 이를 대조군 수준의 약 열 배로 높였다. 메틸렌 블루는 두 가지 유도성 활성 성분을 모두 없앴다. 해당 조직에서 그 용량과 측정 시점의 칼슘 의존성 상시 활성은 변하지 않았다.

이 결과는 서술된 그대로 읽어야 한다. 즉, 해당 조건에서 측정된 iNOS 유형의 활성이 억제되었다는 뜻이다. 유전자 발현을 측정한 것이 아니며, eNOS나 nNOS보다 iNOS를 언제나 선택적으로 억제한다는 증거도 아니다. 정제 효소 연구는 이러한 주의점을 더욱 분명히 한다. 정제된 NOS와 구아닐산 고리화효소 비교 연구에 따르면, 정제된 산화질소 합성효소를 직접 분석했을 때 메틸렌 블루는 30 micromolar에서 시트룰린 생성을 완전히 차단했다. 반수 억제 농도는 초과산화물 불균등화효소가 없을 때 약 5.3 micromolar, 있을 때 9.2 micromolar였다. 별도의 정제 nNOS 연구에서는 효소에 결합된 헴의 산화가 관여하는 것으로 나타났다. 핵심은 분리된 실험계에서 직접적인 NOS 억제가 실제로 일어나지만, 시상하부의 결과를 메틸렌 블루가 모든 부위의 상시 발현 NOS에는 영향을 주지 않는다는 일반적인 주장으로 확대할 수는 없다는 것이다.

고리 3: 산화질소가 도착하기 전에 소실된다

효소 차단 이외의 현상으로도 고리형 GMP 감소를 설명할 수 있음을 가장 명확하게 보여 준 실험은 배양된 토끼 폐동맥 평활근세포에서 이루어졌다. 혈관 평활근 초과산화물 연구에서는 산화질소 공여체를 직접 첨가하여 내인성 NOS 단계를 완전히 우회한 다음, 메틸렌 블루가 여전히 고리형 GMP 반응을 억제하는지 확인했다.

S-니트로소-L-시스테인, 니트로프루시드 나트륨, MPANO라고 부르는 안정적인 탈아미노화 유사체의 세 가지 공여체를 1에서 100 micromolar 범위에서 시험했다. 모두 고리형 GMP를 대략 1.5배에서 12배로 높였다. 10 micromolar의 메틸렌 블루는 앞의 두 공여체에 대한 반응을 51에서 100 percent 억제했지만, MPANO 반응은 변화시키지 않았다. 메틸렌 블루가 단순히 고리화효소의 촉매 부위를 차단하는 것이라면 이러한 공여체별 선택성을 설명하기 어렵다. 세 공여체 모두 동일한 하위 효소로 이어지기 때문이다.

이후 세 가지 대조 실험을 통해 기전이 초과산화물과 관련됨을 확인했다. 첫째, 잔틴과 잔틴 산화효소로 세포외 초과산화물을 생성하자 동일한 양상이 재현되었다. CYSNO와 니트로프루시드에 대한 반응은 차단되었지만, MPANO 반응은 유지되었다. 둘째, 메틸렌 블루는 평활근세포에서 용량 및 시간 의존적으로 초과산화물 생성을 유발했으며, 이를 시토크롬 c의 환원으로 측정했다. 셋째, 초과산화물 불균등화효소는 억제를 완전히 막았지만 카탈라아제는 그렇지 않았다. 이는 해당 실험계에서 직접적으로 작용한 화학종이 과산화수소가 아니라 초과산화물이었음을 시사한다.

공동배양 방식의 실험도 설명할 가치가 있다. 효과가 어느 공간에서 발생하는지 보여 주기 때문이다. 커버글라스 위의 내피세포를 평활근세포와 짧게 공동배양하자, 기저 상태에서 방출된 내피 유래 인자가 평활근의 고리형 GMP를 세 배에서 여덟 배로 높였다. 어느 쪽 구획이든 메틸렌 블루로 전처리하면 그 신호가 감소했으며, 초과산화물 불균등화효소는 내피세포 전처리의 효과를 부분적으로 되돌렸다. 다시 말해, 메틸렌 블루가 반드시 신호 감지기 역할을 하는 평활근세포 내부에서 작용해야 하는 것은 아니다. 전달 중인 신호 분자를 제거하여 신호를 낮출 수도 있다. 메틸렌 블루 연구를 읽는 지침에서는 이를 일반 원칙으로 다룬다. 분자 표적을 명명하기 전에 개입이 일어난 구획부터 명시해야 한다.

이를 NOS 억제라고 부르는 것은 잘못이다. 공여체가 작동하는 데 합성효소 단계가 필요하지 않았는데도 신호가 감소했기 때문이다.

고리 4: 감지기 자체의 반응이 줄어든다

가용성 구아닐산 고리화효소에 대한 직접적인 효과도 존재하지만, 농도가 중요하다. 앞서 인용한 정제 효소 비교 연구에서 산화질소로 자극한 고리화효소를 절반 수준으로 억제하려면 약 60 micromolar의 메틸렌 블루가 필요했다. 반면 NOS의 반수 억제 농도는 약 5에서 9 micromolar였고, 고리화효소는 1 millimolar에서도 최대 억제 정도가 부분적인 수준에 그쳤다. 이는 대략 여섯 배에서 열한 배의 차이다. 따라서 낮은 micromolar 농도의 세포 실험에서 고리형 GMP가 감소했다고 해서, 그 수치만으로 선택적인 고리화효소 억제라고 규정할 수는 없다.

후속 산화환원 연구는 두 번째 주의점을 제시했다. 메틸렌 블루는 산화질소로 활성화된 고리화효소를 비활성화했지만, 그 기전은 공기에 의한 단순한 헴 철의 산화와 달랐다. 따라서 감지기의 기능이 저하될 수는 있으나, 그 화학적 기전은 아직 확정되지 않았다. 또한 농도 차이를 고려하면 낮은 micromolar 농도에 노출된 경우에는 초과산화물과 NOS의 영향을 먼저 배제해야 한다. 포스포디에스테라아제에 대한 대조도 이 단계에서 고려해야 한다. 분해를 측정하거나 차단하지 않았다면, 고리형 GMP 축적의 감소는 합성 감소, 분해 가속 또는 둘 모두로 설명될 수 있다.

이를 하나의 혈압 관련 주장으로 단순화할 수 없는 이유

각 고리는 서로 다른 실험계에서 확인되었다. 대식세포의 전사는 시상하부의 효소 활성과 다르다. 지질다당류 투여 후의 시상하부 활성은 안정 상태의 혈관 내피가 조절하는 긴장도와 다르다. 공동배양에서 기저 상태로 방출된 내피 유래 인자는 작용제로 자극한 혈관 확장과 다르다. 10 micromolar의 메틸렌 블루에 노출된 배양 폐동맥세포는 사람의 순환계가 아니다. 이들을 메틸렌 블루가 산화질소를 차단하여 혈압을 높인다는 식의 문장으로 뭉뚱그리면, 대조 실험이 보존하려 했던 바로 그 구분을 버리게 된다.

세 가지 확인 사항을 지키면 설명이 근거에 충실해진다. 첫째, 동형효소를 명시한다. 안정 상태의 혈관 긴장도에는 eNOS, 염증으로 유도되는 산화질소 생성에는 iNOS, 신경계 및 일부 정제 효소 실험에는 nNOS가 해당한다. 둘째, 산화질소 신호가 공급된 방식을 명시한다. 내인성 합성인지, 내피에서의 기저 방출인지, CYSNO, 니트로프루시드, MPANO 같은 특정 공여체인지 구분해야 한다. 불안정한 공여체와 달리 안정적인 공여체는 메틸렌 블루의 영향을 받지 않았기 때문이다. 셋째, 농도와 회복 조건을 명시한다. 초과산화물 불균등화효소에 의한 회복은 초과산화물의 관여를 시사하고, 카탈라아제의 회복 실패는 해당 실험계에서 과산화수소가 원인이라는 해석에 반대되는 근거가 된다. 잔틴 산화효소에 의한 재현은 그것만으로도 효과를 일으킬 수 있음을 보여 주며, 정제 효소 분석은 직접적인 촉매 작용에 대한 효과와 전달 중의 신호 소실을 구분한다.

간단히 종합하면 다음과 같다. 메틸렌 블루는 선택적인 고리화효소 차단제라기보다 산화질소에서 고리형 GMP로 이어지는 신호전달의 여러 부위에 영향을 주는 물질로 보는 편이 적절하다. 실험계와 농도에 따라 iNOS 전사인자의 결합을 줄이고, NOS 효소를 직접 억제하며, 초과산화물 생성을 통해 산화질소 가용성을 낮추고, 산화질소로 활성화된 고리화효소의 기능을 저하시킬 수 있다. 혈관 연구에서 고리형 GMP 신호전달의 역할과 세포 분석에 사용되는 산화질소 공여체 비교는 각각 이들 분기 중 하나를 더 자세히 다룬다. 또한 산화환원 효과와 효소 효과를 구분하는 방법에서는 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 안정적인 공여체 대조가 이 분야의 문헌에 자주 등장하는 이유를 설명한다.

메틸렌 블루 처리 후 고리형 GMP 수치가 낮다는 것은 사슬이 끊어졌음을 보여 준다. 어느 고리가 끊어졌는지는 대조 실험만이 알려 준다.