Мақала
Микроскопияда метилен көгіне баламалар: міндетке қарай таңдаңыз
Қарапайым бактериялық жағындыда мақсат жасуша пішінін көру болса, метилен көгінің орнына кристалл күлгінді қолдануға болады. Тірі жасушалар үшін ең қолайлы балама мүлде бояғыш қолданбайтын фазалық-контрастты микроскопия болуы мүмкін. Таңдау қандай бақылау жүргізу қажет екеніне байланысты.
Екі адам бір бактериялық өсіндіні зерттеп жатыр делік. Біреуі таяқша тәрізді жасушаларды дөңгелек жасушалардан ажыратқысы келеді. Екіншісі өңдеудің бактерияларды өлтірген-өлтірмегенін білгісі келеді. Бірінші адамға айқын кескін беретін бояғыш екінші адамға қолдануға болатын жауап бермеуі мүмкін.
Баламаны таңдамас бұрын мына сөйлемді аяқтаңыз: «Маған ___ ішінде ___ бақылау қажет, ал жасушалар тірі қалуы тиіс / тірі қалуы міндетті емес.» Бұл сөйлем бояғыш атқаруы тиіс міндетті анықтайды.
Алдымен үлгі мен сұрақты анықтаңыз
Алдымен жасушалардың тірі қалуы қажет пе, соны анықтаңыз, содан кейін бақылау керек белгіні белгілеңіз:
- Жасушалар тірі қалуы тиіс: қозғалыс немесе пішін үшін бояусыз фазалық контрастты немесе DIC әдісін қарастырыңыз; ядролық ДНҚ үшін флуоресценциямен Hoechst 33342 қарастырыңыз; мембрана тұтастығы үшін SYTO 9 мен пропидий йодиді сияқты валидацияланған талдауды таңдаңыз.
- Жасушалардың тірі қалуы міндетті емес: бактериялық морфология үшін кристалл күлгінмен қарапайым бояуды немесе нигрозинмен негативті бояуды қарастырыңыз; Грам реакциясы үшін толық Грам бойынша бояу әдісін қолданыңыз; бекітілген жасушалардағы ядролық ДНҚ үшін DAPI флуоресценциясын қарастырыңыз.
Әр тармақтың шектеулерін салыстыру үшін осы кестені пайдаланыңыз. Бұлар — қолданыстағы хаттамада бір құтыны екіншісіне ауыстыру жөніндегі нұсқаулар емес, әдіс таңдау нұсқалары.
| Нені бақылау қажет | Үлгі және жабдық | Ықтимал балама | Негізгі шектеу |
|---|---|---|---|
| Бактериялардың пішіні мен орналасуы | Дайындалған бактериялық жағынды; жарық өрісті микроскопия | Кристалл күлгінмен қарапайым бояу | Морфологияны көрсетеді; Грам реакциясын немесе тіршілікке қабілеттілікті анықтамайды. |
| Қараңғы фондағы жасуша контурлары | Бактериологиялық препарат; жарық өрісті микроскопия | Нигрозинмен негативті бояу | Препаратты дайындау мен құрам маңызды; боялмаған жасуша міндетті түрде тірі емес. |
| Грам реакциясы | Дайындалған бактериялық жағынды; жарық өрісті микроскопия | Толық Грам бойынша бояу әдісі | Реагенттердің толық реттілігі мен бақылау үлгілері қажет. |
| Тірі жасушалардың қозғалысы немесе өзгерістері | Үйлесімді ылғалды препарат; фазалық контраст немесе DIC | Бояғышсыз | Тиісті оптика қажет; контраст белгілі бір молекуланы анықтамайды. |
| Ядролық ДНҚ | Бекітілген жасушалар; флуоресценция | DAPI | Үйлесімді қоздыру және сәуле шығару сүзгілері қажет. |
| Тірі жасушалардағы ядролық ДНҚ | Тірі жасушалар; флуоресценция | Hoechst 33342 | Жасушаға енуі бейнелеу жағдайларының зиянсыз екенін дәлелдемейді. |
| Бактериялық мембрананың тұтастығы | Бекітілмеген бактериялар; флуоресценция | SYTO 9 және пропидий йодиді | Мембрананы бояу — тіршілікке қабілеттіліктің жанама өлшемі. |
Қарапайым жағынды үшін әдісті абайлап ауыстырыңыз
Міндет бактериялық морфологияны бір түспен көру болса, кристалл күлгін практикалық үміткер болып табылады. FDA-ның Bacteriological Analytical Manual құжатында қарапайым бояуға жарамды кристалл күлгіннің екі құрамы берілген. Құжатталған құрамды және соған арналған дайындау әдісін қолданыңыз; бояғыштың атауы ғана жұмыс реагентінің нақты құрамын анықтамайды.
Кристалл күлгін Грам бойынша бояуда да қолданылады, бірақ бұл кристалл күлгінмен қарапайым бояуды Грам бойынша бояуға айналдырмайды. ASM-нің Грам бойынша бояу хаттамасында дифференциалды нәтиже кристалл күлгін, йод, түссіздендіру және қарсы бояудың ретімен әсер етуіне байланысты. Бұл қадамдарды өткізіп жіберу кескіннен қандай қорытынды жасауға болатынын өзгертеді. Осы айырмашылық туралы қарапайым бояу мен Грам бойынша бояу материалынан қараңыз.
Нигрозин контурларды көрсетудің басқа тәсілін ұсынады: ол фонды қарайтады, ал бактериялық жасушалар салыстырмалы түрде ашық болып қалады. Merck-тің нигрозин жөніндегі нұсқаулығында баламалардың жалпы тізімінде байқалмай қалуы мүмкін маңызды бір егжей-тегжей бар. Көрсетілген жұмыс құрамында формальдегид бар. Сондықтан жасушалардың өздері боялмаған болып көрінсе де, «негативті бояу» деген атауға қарап оның тірі жасушалармен үйлесімді екенін қорытындылауға болмайды. Толық құрам мен үлгіні дайындау әдісін тексеріңіз.
Тірі үлгілер үшін оптиканы өзгертуді қарастырыңыз
Жасушалардың қозғалуын немесе бөлінуін бақылағыңыз келсе, тағы бір бояғыш енгізу бақылауды қиындатуы мүмкін. Nikon компаниясы мөлдір үлгілердегі контраст жөніндегі нұсқаулығында түсіндіргендей, фазалық контраст пен дифференциалды интерференциялық контраст, яғни DIC, үлгілерді олардың оптикалық қасиеттеріндегі айырмашылықтар арқылы көрінетін етеді. Микроскопта қажетті компоненттер болса, бұл әдістер тірі, боялмаған жасушаларды көрсетуі мүмкін.
Бұл таңдау препаратты бояусыз сақтайды, бірақ қолжетімді ақпаратты өзгертеді. Контрастты қай молекула тудырғанын білмей-ақ, шекараны немесе қозғалысты бақылауға болады. Егер сұрақ молекуланың орналасуына қатысты болса, тиісті таңбалау әдісін таңдаңыз.
Ядролық ДНҚ үшін Invitrogen компаниясының DAPI және Hoechst бояғыштарын салыстыруы DAPI-дің бекітілген жасушаларда кең қолданылуын және жасушаға жақсырақ өтетін, тірі жасушаларды таңбалау үшін көбірек қолданылатын Hoechst 33342-ні ажыратады. Екеуіне де флуоресцентті жабдық қажет. Екеуі де жарық өрісті микроскопияда қолданылатын түсті бояғыштың тікелей алмастырушысы емес.
Бояғыш әсері мен жарықтандыруды эксперименттік жағдайлар ретінде қарастырыңыз. Егер өлшенетін көрсеткіш жасушалардың мінез-құлқы болса, боялған және боялмаған препараттарды салыстырыңыз.
Қызыл жасуша автоматты түрде өлі жасуша емес
SYTO 9 және пропидий йодиді бактериялық мембрананың тұтастығын бағалау үшін жиі бірге қолданылады. BacLight нұсқаулығы тұтас мембраналарды жасыл боялумен, ал зақымдалған мембраналарды қызыл боялумен байланыстырады. Бұл түсіндірмені нақты үлгі үшін валидациялау қажет.
Розенберг және әріптестері жүргізген 2019 жылғы зерттеу мәселені көрсетеді. Фосфатты-буферлі тұз ерітіндісіндегі шыныда өсірілген 24 сағаттық E. coli биоқабықшаларында жасушалардың шамамен 96% in situ жағдайда пропидий-йодид-оң болып көрінді. Алайда авторлар жинап алғаннан кейін олардың 82% өсіруге жарамды деп бағалады. Конфокальды кескіндерде қызыл боялған материалдың астында ішкі бөлігі жасыл жасушалар көрінді, бұл жаңылыстыратын сигналға жасушадан тыс нуклеин қышқылдарының қатысы бар екенін көрсетті.
Бұл пайыздар әмбебап түзету коэффициентін емес, зерттеудегі препараттарға жүргізілген әртүрлі өлшемдерді сипаттайды. Пайдалы қорытынды — сигналдың неден пайда болғанын тексеру. Биоқабықшада нуклеин қышқылына арналған бояғыш зақымдалған жасушалардың ішіндегі материалмен қатар жасушалардан тыс материалды да анықтай алады. Тіршілікке қабілеттілік туралы қорытынды жасау үшін зерттеушілер әрқайсысының өз шектеулері бар екенін ескере отырып, өсіру немесе метаболикалық белсенділік сияқты қосымша өлшемдерді қолдануды ұсынады.
Баламаның нақты құрамын тексеріңіз
Баламалы бояу әдісінің құрамында метилен көгі әлі де болуы мүмкін. Giemsa — соның бір мысалы: Merck өз өнімін қан мен сүйек кемігі жағындыларын қоса алғанда әртүрлі қолдануға арналған azure-eosin-methylene-blue ерітіндісі деп сипаттайды. Бұл басқа үлгіге арналған басқа әдіс болуы мүмкін, бірақ метилен көгін алып тастау талабын қанағаттандырмайды.
Егер белгілі бір қосылысты қолданбау эксперименттің бір бөлігі болса, кескіндерді салыстырмас бұрын реагенттің сәйкестігі мен құрамын тексеріңіз. Метил көгі, метилен көгі және атаулары ұқсас бояғыштар жөніндегі нұсқаулық атаулардағы айырмашылықтарды түсіндіреді.
Нәтижені қолданар алдында алмастыруды тексеріңіз
Жаңа әдіс үшін репрезентативті үлгілер мен тиісті бақылауды пайдаланып, шағын салыстыру жасаңыз. Мүмкіндігінше микроскоп параметрлерін салыстырмалы күйде сақтаңыз. Жақсырақ көрінетін кескінді жай ғана артық көрмей, оның себебін зерттеуге мүмкіндік беру үшін реагент құрамын, үлгіні дайындауды, әсер ету жағдайларын және бейнелеу параметрлерін тіркеңіз.
Табысты бастапқы сұраққа сәйкес бағалаңыз. Морфология үшін жасуша шекаралары мен орналасуының түсінікті болып қалуын бағалаңыз. Ядролық таңбалау үшін сигналдың орналасуы мен фонды бағалаңыз. Тіршілікке қабілеттілік үшін тартымды түстік ажыратудан тыс дәлел талап етіңіз. Метилен көгімен бояу және зертханалық қолдану жөніндегі кеңірек нұсқаулық бақылау мен препаратты дайындаудың өзара байланысын түсіндіреді.
Қажетті өлшемді сақтайтын баламаны таңдаңыз. Түс — алынған кескіннің қасиеттерінің біреуі ғана.