Мақала
Метилен көгі және жасушалық сенесценция: фибробласт тәжірибелері нені өлшейді
Жиі кездесетін қате түсінік мынадай. Мақалада метилен көгі өсірілген фибробласттардың популяциясына 20-дан астам қосымша екі еселену бергені хабарланады, ал оқырман бұдан ол сенесцентті жасушаларды жояды немесе адамның өмірін шамалас мөлшерге ұзартады деген қорытынды шығарады. Мұндай тұжырым қисынды көрінеді. Бірақ ол екі бөлек тұста қате.
Мәселенің түп-төркіні сандарда емес, ұғымдарда. Популяцияның екі еселенуі, сенесценция маркерлері және теломер өлшемдері әрқайсысы бөлек сұраққа жауап береді. Метилен көгі жөніндегі фибробласт зерттеулерін зертханалық ыдыстағы жасушаның бір түрінде сенесценцияға өтудің кешігуін зерттеген, митохондриялық өлшемдермен расталған жұмыс ретінде қарастырған дұрыс. Бұл бұрыннан сенесцентті жасушаларды іріктеп жоюдан да, тұтас ағзаның қартаюынан да бөлек. Осы айырмашылықтың кеңірек мәнмәтіні митохондриялық электрон тасымалы жасуша энергиясын қалай қалыптастыратынын және метилен көгі зерттеулеріндегі тұжырымдарды қалай түсіндіру керектігін қамтиды.
Популяцияның екі еселенуі жастықты емес, өткен бөлінулерді есептейді
Негізгі нәтижелердің көбі IMR90 жасушаларынан алынған. Бұл — репликациялық қабілеті шектеулі, қалыпты адам ұрығының өкпе фибробласттарының штамы. Метилен көгі мен IMR90 фибробласттарының репликациялық өмір ұзақтығы туралы алғашқы зерттеуде жасуша дақылдары белгіленген кесте бойынша қайта егілді, ал дақыл бөлінуді тоқтатқанша популяцияның жинақталған екі еселену саны тіркелді. Негізінен 100 nM деңгейіндегі наномолярлық концентрациялармен өңдеу дақылдарға бөліну тоқтағанға дейін 20-дан астам қосымша екі еселену жинауға мүмкіндік берді.
Популяцияның екі еселенуі — есеп жүргізу бірлігі. Ол популяцияның шамамен неше рет екі еселенгенін тіркейді. Ол жеке жасушаның сенесцентті, уақытша тыныштық күйінде, дифференцияланған немесе өлі екенін тікелей көрсетпейді. Жасушалар бөліну қабілетін ұзағырақ сақтағандықтан, стресс кезінде ерте тоқтайтын жасушалар азайғандықтан немесе жағдайлар пролиферацияға қабілетті субпопуляцияны іріктегендіктен дақылдағы екі еселену саны артуы мүмкін. Санның өзі бұл жолдарды ажырата алмайды.
Сондықтан екі еселену саны маркерлермен бірге қарастырылады. Сан пролиферацияның қанша уақытқа созылғанын көрсетеді. Маркерлер бөлінуі тоқтаған немесе тірі қалған жасушалардың қандай күйге өткенін көрсетеді.
Соңғы көрсеткіштерге арналған нұсқаулық: әр маркер нені көрсетеді
Дақылдағы сенесценция — бірнеше тәуелсіз өлшем арқылы анықталатын фенотип. Бір ғана бояу немесе ақуыз оны дәлелдей алмайды.
DNA синтезінің жоғалуымен қатар жүретін өсудің тоқтауы. Тұрақты тоқтау BrdU немесе EdU қосылуының азаюы, жалпақ морфология және қайта егілгеннен кейін өсудің қалпына келмеуі арқылы тексеріледі. Бұл сенесцентті тоқтауды уақытша тыныштық күйінен ажыратады.
Сенесценциямен байланысты бета-галактозидаза. SA-beta-gal бояуы pH 6.0 шамасындағы лизосомалық белсенділікті көрсетеді. Лизосома массасы артқан сайын сенесцентті фибробласттарда көбіне оң боялу байқалады. Бұл белгі сенесценцияға ғана тән емес, сондықтан ол пролиферация және молекулалық маркерлермен бірге түсіндіріледі.
p16 және p21 жолдары. p16 CDK4, CDK6 және RB жолы арқылы әсер етеді. p21 көбіне p53 арқылы индукцияланады. Олардың деңгейінің өсуі бөлінудің тоқтағанын қолдайды, бірақ екі ақуыздың ешқайсысы сенесценцияға ғана тән емес.
Секрециялық күй. Сенесценциямен байланысты секрециялық фенотип, немесе SASP, цитокиндер, хемокиндер, өсу факторлары мен протеазалардың бөлінуіндегі өзгерістерді білдіреді. SASP факторларына арналған RNA немесе ақуыз талдаулары жасушалардың көрші жасушаларға қалай сигнал беретінін сипаттайды. Олар репликациялық қабілетті тікелей өлшемейді.
Тотықтырғыштар және митохондриялық көрсеткіштер. Метилен көгі туралы мақалалар митохондриялық өлшемдер қабатын қосады: IV кешеннің мөлшері мен белсенділігі, оттегі тұтыну, гем синтезі, мембрана массасы, мембраналық потенциал, ATP және тотықтырғыш сигналдары. Бұлар бөлінудің кеш тоқтауымен қатар жүретін метаболизмдік күйді сипаттайды. Олар өздігінен сенесценцияны анықтамайды, бірақ ұсынылған механизмді тексереді. NAD(P)H метилен көгін тотықсыздандырып, цитохром c оны қайта тотықтыратын тотығу-тотықсыздану циклі моделі сол тотығу-тотықсыздану циклін тотықтырғыштар түзілуінің азаюымен байланыстыратын IMR90 зерттеуінде баяндалған. Дозалау мен таралудың осыған қатысты қисыны метилен көгінің фармакологиясы және тіндердің оған ұшырауы туралы материалда қарастырылады.
Теломерлердің қысқару жылдамдығы. Дұрыс өлшем — бір уақыт нүктесіндегі ұзындық емес, апталар бойы әр екі еселенуде жоғалған негіз жұптарының саны. Баяу қысқару әр репликацияда ұзындықтың азырақ кемуін білдіреді. Бұл ұзаруды білдірмейді, ал стресс теломерлер аз өзгергеннің өзінде IMR90 жасушаларының бөлінуін тоқтата алады.
Фибробласттарға арналған үш зерттеу сызбасын салыстыру
Бұл беттің арнайы әзірленген материалы — төмендегі салыстыру. Ол жасуша түрін, әсер ету жағдайын, өлшемді және шектеуді бір жерге жинақтайды.
| Зерттеу | Жасушалар және әсер ету жағдайы | Не өлшенді | Нені көрсете алмайды |
|---|---|---|---|
| Atamna және әріптестері, FASEB J 2008 | Қалыпты IMR90 фибробласттары, наномолярлық метилен көгімен ұзақ мерзімді өңдеу, стандартты жағдай ретінде 100 nM | Жинақталған екі еселену саны, IV кешеннің мөлшері, оттегі тұтынудың 37-ден 70 пайызға дейін артуы, гем синтезі, сутек пероксиді немесе кадмий туғызған мерзімінен бұрын сенесценциядан қалпына келу, HepG2 жасушаларындағы 2-фаза ферменттері | Сенесцентті жасушаларды жою тексерілмеген. Жануарлар немесе адамдардың өмір ұзақтығына қатысты соңғы көрсеткіш жоқ. Мұндағы репликациялық өмір ұзақтығы зертханалық ыдыстағы екі еселену санын білдіреді. |
| Atamna және әріптестері, Redox Biology 2015, AMPK және IV кешеннің биогенезі жөніндегі кейінгі механистік зерттеуде сипатталған | IMR90 фибробласттары, негізінен 100 nM метилен көгі; салыстыру үшін ұзақ мерзімді AMPK белсендіргіші ретінде AICAR қолданылған | NAD пен NADH арақатынасының уақыт бойынша өзгерісі, AMPK-ның қысқа мерзімді фосфорлануы, PGC-1alpha және SURF1 индукциясы, IV кешен белсенділігінің 100 пайыздан астам артуы, тотықтырғыштардың 28 пайызға төмендеуі, теломерлердің баяуырақ қысқаруы, AICAR кезіндегі шамамен 2-мен салыстырғанда шамамен 18 қосымша екі еселену, жасуша цикліне әсердің болмауы | AICAR-мен салыстыруда доза шамамен 1000 есе және әсер ерекшелігі бойынша айырмашылық бар, сондықтан ол теңестірілген әсер күшін емес, белсену сипатын тексереді. Теломер нәтижесі апталар бойы бөлінетін дақылдарға қатысты. |
| Xiong және әріптестері, Aging Cell 2016, прогерия фибробласттарындағы митохондриялық және ядролық қалпына келуді зерттеген жұмыста баяндалған | Хатчинсон–Гилфорд прогериясындағы терінің бастапқы фибробласттары және оларға сәйкестендірілген қалыпты бақылау жасушалары, көбіне 5-тен 12 аптаға дейін 100 nM | Флуоресценттік және электрондық микроскопия арқылы митохондрия пішіні, тірі жасушаларды бейнелеу арқылы қозғалғыштық, супероксид, мембраналық потенциал, ATP, PGC-1alpha, пролиферация және сенесценция маркерлері, сондай-ақ ядроның бүртіктенуі, прогериннің орналасуы, гетерохроматин және ген экспрессиясы | Бұл — қалыпты қартаю емес, нақты ауруға тән мерзімінен бұрын қартаю моделі. Морфология мен маркерлердің қалпына келуі сенесцентті жасушалардың жойылуын білдірмейді. Жануарлардағы тиімділік немесе клиникалық соңғы көрсеткіш жоқ. |
| Xue және әріптестері, Cells 2021 шолуы, метилен көгін қартаюға қарсы ықтимал қосылыс ретінде қарастырған шолуда қорытындыланған | Мидың қартаюы, нейродегенерация, тері, жараның жазылуы және прогерия туралы әдебиеттерді біріктіріп талдау | Метилен көгін I және III кешендердегі электрон тасымалының кейбір бөліктерін айналып өте алатын каталитикалық тотығу-тотықсыздану циклін жүргізуші қосылыс ретінде, қартаюдың еркін радикалдық теорияларымен салыстыра сипаттайды | Тек баяндаушы шолу. Ол гипотезаларды жүйелеп, клиникалық дәлелдер әлі де нақты қорытынды бермейтін тұстарды атап өтеді. |
Бір ғана жолдан гөрі барлық жолдардағы ортақ үрдіс маңызды. Төмен дозалы метилен көгі қайта-қайта ұзағырақ пролиферация кезеңімен, IV кешеннің жоғары белсенділігімен, тотықтырғыш сигналдарының төмендеуімен және морфологияның жақсаруымен байланысты байқалады. Зерттеу сызбасы бойлық болып қалады: бөлініп жатқан жасушалардан бастау, олардың саны артқан кезде өңдеу және бөлінудің қанша уақыт жалғасатынын тіркеу. Мұндай құрылым кешіктіру туралы тұжырымды қолдай алады. Басқа зерттеу сызбасынсыз ол жою туралы тұжырымды қолдай алмайды.
Сенесценцияны кешіктіру сенесцентті жасушаларды жою емес
Кешіктіру дегеніміз — бөлініп жатқан жасушалардың тоқтағанға дейін ұзағырақ бөлінуі. Көбіне сенолитикалық әсер деп аталатын жою бұрыннан сенесцентті жасушалардың іріктеп өлтірілуін немесе санының азайтылуын, ал пролиферацияланатын көрші жасушалардың тірі қалуын білдіреді.
Метилен көгі туралы фибробласт әдебиеті бірінші сызбаны тексереді. Дақылдар бастапқыда пролиферацияланады, бірізді қайта егу барысында өңделеді және бөлінуді кейінірек тоқтатады. Сондықтан SA-beta-gal, p16, p21 және SASP факторлары сияқты маркерлер кейінірек пайда болады немесе белгілі бір пассажда төменірек деңгейде болады. Басталу уақыты жылжығанда мұндай көрініс күтіледі. Ол сенесценциясы бұрыннан қалыптасқан қандай да бір жасушаның жойылғанын дәлелдемейді.
Сенолитикалық әсер туралы тұжырымға басқа тәжірибе қажет: алдымен дақылды расталған сенесценция күйіне жеткізу, содан кейін қосылысты қолдану, одан соң тіршілікке қабілеттілік пен өлімді тікелей өлшей отырып, пролиферацияланатын бақылау жасушаларымен салыстырғанда сол сенесцентті жасушалардың іріктеп жоғалғанын көрсету. Бір маркердің төмендеуі жеткіліксіз, өйткені экспрессия жасуша жоғалмай-ақ өзгеруі мүмкін, ал қалған пролиферацияланатын жасушалар ыдысты толтырып өсе алады. Келтірілген төрт дереккөздің ешқайсысы метилен көгі үшін осындай іріктеп азайту сызбасын қолданбайды. Сондықтан дәл сипаттама — сенолитикалық әсер емес, in vitro жағдайында сенесценцияны кешіктіретін немесе сенесценцияға қарсы белсенділік. Бұл айырмашылықтың тотығу стрессіне қатысты жағы жасушалар оттегінің реактивті түрлерін қалай бақылайтыны туралы материалда толығырақ түсіндіріледі.
Қысқа мерзімді сигнал беру нәтижесі бұл ойды нақтылай түседі. 2015 жылғы IMR90 зерттеуінде метилен көгі NAD пен NADH арақатынасының қысқа мерзімді өсуін және AMPK-ның қысқа мерзімді фосфорлануын, содан кейін IV кешеннің биогенезімен байланысты PGC-1alpha мен SURF1 индукциясын туғызды. AICAR арқылы AMPK-ны ұзақ мерзімді белсендіру қосымша екі еселену саны бойынша әлдеқайда нашар нәтиже берді.
Репликациялық өмір ұзақтығы адамның ұзақ өмір сүруімен бірдей емес
Жасушаның репликациялық өмір ұзақтығы оттегі, қоректік орта және қайта егу ырғағы тұрақты бақыланатын зертханалық ыдыста бөліну тоқтағанға дейінгі екі еселену санын есептейді. Адамның өмір ұзақтығы ондаған жылдық дамуды, иммундық жүйені, қан тамырлары жүйесін, дің жасушаларының нишаларын, мінез-құлықты және ауруларды біріктіреді. Қосылыс біріншісін ұзартып, екіншісін өзгертпеуі мүмкін; көпшілігінде солай болады.
Прогерия фибробласттарында прогерин түзетін нақты LMNA мутациясы бар. Оларға бөлшектенген және қозғалғыштығы төмен митохондриялар, төмен ATP, пішіні бұзылған ядролар және гетерохроматиннің жоғалуы тән. Наномолярлық метилен көгі митохондриялық көрсеткіштерді жақсартып, ядролық көрсеткіштерді едәуір қалпына келтірді, соның ішінде прогериннің мембранадан босап шығуын қамтамасыз етті. Бұл — жасуша деңгейіндегі айқын қалпына келу. Дегенмен бұл әлі де фибробласттардан алынған нәтиже, ал авторлар жануарларға сынақ жүргізуді болашақ жұмыс ретінде ұсынған. Ауру моделінің өзі прогерия және мерзімінен бұрын қартаю модельдеріндегі метилен көгі туралы материалда толығырақ талқыланады.
Осыдан зерттеуді оқуға арналған практикалық тексеру тізімі шығады.
- Өңдеу бөліну тоқтағанға дейін басталды ма, әлде тоқтау орныққаннан кейін басталды ма, соны сұраңыз. Оған дейін басталуы кешіктіруді қолдайды. Жоюды көрсету үшін одан кейінгі өңдеу және іріктеп өлу деректері қажет.
- Бақылау тобындағы екі еселену қисығы қалай өзгергенін сұраңыз. Жинақталған екі еселену саны болмаса, маркер өзгерістері негізгі мәнмәтіннен ажырап қалады.
- Бір ғана бояудың орнына кемінде екі маркер санатын сұраңыз, мысалы, пролиферация белгісімен бірге p16 немесе p21 және SA-beta-gal.
- Теломерлер туралы нәтижелер қалай берілгенін сұраңыз. Уақыт бойындағы әр екі еселенуге шаққандағы қысқару жылдамдығы мәнді. Бір сәттегі ұзындық өлшемі мұндай ақпарат бермейді.
- Не тұрақты ұсталғанын сұраңыз. Қайта егу кезіндегі жасуша тығыздығы, оттегі, қоректік ортаны ауыстыру және метилен көгінің жаңадан дайындалған не ұзақ сақталған бастапқы ерітінділері фибробласттардың бөлінуінің тоқтауына әсер етеді.
Осылай оқығанда, фибробласт әдебиеті метилен көгіне қисынды, бірақ шектеулі рөл береді: ол — өсірілген адам фибробласттарындағы репликациялық сенесценцияны кешіктіріп, митохондриялық көрсеткіштерді жақсартатын төмен дозалы, тотығу-тотықсыздану тұрғысынан белсенді қосылыс. Механизм туралы ең нақты деректер қысқа мерзімді энергетикалық сигнал беру мен IV кешеннің биогенезіне қатысты, ал бұл мақалаларда сенесцентті жасушалардың жойылуы немесе адамның өмір ұзақтығының артуы көрсетілмеген.