Метилен көгі және көру: торлы қабық зерттеулері және олардың шектеулері

Оқырман метилен көгі торлы қабықты қорғаған зерттеуге кезігіп, орынды сұрақ қояды: оны көзге енгізу керек пе? Метилен көгінің көруге қатысын зерттеген жұмыстар бұл сұраққа жауап бермейді, өйткені негізгі зерттеулердің ешқайсысы мұндай қолдануды сынамаған. Бірінде бояғышты уытпен бірге тышқандардың шыны тәрізді денесіне енгізген. Екіншісінде оны зертханалық ыдыстағы оқшауланған жасушаларды қоршаған ортаға қосқан. Үшіншісінде оны мутант тышқандардың ауыз суына қосқан. Әр нәтиже өз енгізу жолы мен моделінің аясында ғана қарастырылуы тиіс.

Бұл мақалада үш клиникаға дейінгі зерттеу, торлы қабық жасушаларының екі түрі және зертханалық қорғау мен көзді клиникалық емдеу арасындағы шекара қарастырылады. Ортақ заңдылық айқын: бақыланатын жағдайларда метилен көгі торлы қабық жасушаларындағы митохондриялық стреске әсер ете алады, бірақ бұл нәтиже бөлшек саудадағы ерітінділерді көзге қолдануға негіз болмайды.

Жасушалардың екі түрі, екі түрлі ауру

Торлы қабық бірнеше қабаттан тұрады, сондықтан қай қабат зерттелгені маңызды. Жарық алдымен торлы қабықтың сыртқы бөлігіндегі фоторецепторларға түседі. Олардың сигналдары аралық нейрондар арқылы торлы қабықтың ішкі бөлігіндегі ганглиозды жасушаларға өтеді, ал осы жасушалардың аксондары көру жүйкесінің құрамында шығады. Төмендегі сызбада қабаттар ретімен көрсетілген.

Сүтқоректілердің торлы қабығының көлденең қимасы: фоторецепторлардың сыртқы сегменттерінен бастап сыртқы ядролық қабат, ішкі ядролық қабат, ішкі өрімдік қабат және ганглиозды жасушалар қабаты арқылы көру жүйкесіне дейінгі қабаттар белгіленген.

Глаукома мен оптикалық нейропатияда зақымдану қаупіне ұшырайтын жасушалар — торлы қабықтың ганглиозды жасушалары. Іздеу сұрауларында метилен көгі мен глаукома аталғанда, әдетте осы ішкі қабат пен оның аксондары меңзеледі. Ал торлы қабықтың сыртқы бөлігінің дегенерациясында фоторецепторлар зардап шегеді. Олар торлы қабықтағы энергияны ең көп қажет ететін жасушалар және жасушалық тыныс алу мүмкіндігінің шегіне жуық жұмыс істейді. Сондықтан митохондриялық I кешеннің жұмысы бұзылғанда, олардың резерві аз болады. Бір жасуша түріндегі нәтиже екіншісіне автоматты түрде қолданылмайды; төмендегі үш зерттеуде олар бөлек қарастырылған. Модельдерді қорытындылардан ажыратудың жалпы тәсілі метилен көгі туралы зерттеулерді қалай оқу керек мақаласында түсіндірілген.

Тірі тышқан көзіндегі ганглиозды жасушалар

Үш зерттеудің ең алғашқысында зерттеушілер ротенонды тышқанның бір көзінің шыны тәрізді денесіне микроинъекция арқылы енгізіп, оптикалық нейропатия моделін жасаған, ал екінші көзге тек тасымалдаушы ерітінді енгізіп, оны бақылау ретінде пайдаланған. Ротенон митохондриялық I кешенді — электрондарды NADH-тан әрі қарай өткізетін бастапқы буынды — бөгейді. I кешеннің қызметінің бұзылуы бұл модельді ганглиозды жасушалар мен көру жүйкесінің ауруы болып саналатын Лебердің тұқым қуалайтын оптикалық нейропатиясымен де байланыстырады.

Жиырма төрт сағаттан кейін ротенон енгізілген көздердегі ганглиозды жасушалар қабаты бақылау көздеріне қарағанда жұқарып, ондағы жасушалар саны азайған. Метилен көгі ротенонмен бірге енгізілгенде, зақым дозасына тәуелді түрде болдырылмаған: сыналған ең жоғары доза (0.07 mg/kg, тышқанның LD50 көрсеткішінен әлдеқайда төмен) қабаттың қалыңдығын да, жасушалар санын да сақтап қалған. Ми гомогенаттарындағы қатар жүргізілген сынақтар екі әсерді көрсетті: метилен көгі ротенон туғызған тотығу стрессін кері қайтарып, оттегі тұтынуының төмендеуін жойған. Авторлар эксайтоуытты механизмді ұсынды: ротенон реттеуші амакринді жасушаларды зақымдайды, ганглиозды жасушалар шамадан тыс қозады, ал антиоксиданттық әсер соның салдарынан туындайтын зақымды тоқтатады. Бұл қорғаныстың болжамды химиялық негізі метилен көгінің митохондриялық механизмдері мақаласында егжей-тегжейлі қарастырылған.

Бұл нәтижеге үш шектеу тән. Бояғыш уытпен бірге тікелей көзге енгізілген: бұл — енгізу тәсілі, емдеу кестесі емес. Бақылау кезеңі 24 сағат болған. Ал цитохромоксидаза көрсеткіштері зақымданған екі топта да жоғарылаған; авторлар мұны тірі торлы қабықтағы тыныс алудың қалпына келгенінің дәлелі емес, шамадан тыс белсенділік деп түсіндірген.

Зертханалық ыдыста оқшауланған ганглиозды жасушалар

Екінші зерттеуде көздің өзі мүлде қолданылмаған. Зерттеушілер жас егеуқұйрықтардан торлы қабықтың бастапқы ганглиозды жасушаларын бөліп алып, оларға ротенонның, апоптозды қоздыратын стауроспориннің әсерін немесе 72 сағат бойы оттегі тапшылығын қолданған, содан кейін тірі және өлі жасушаларды ажырататын бояу арқылы тірі қалуын бағалаған. Өсіру ортасындағы 1 және 10 micromolar концентрациялы метилен көгі әрбір зақымдаушы әсер жағдайында жасушалардың тірі қалуын жақсартқан: жағдайға қарай шамамен 1.5–1.9 есе. Қосымша сынақ метилен көгінің сутегі асқын тотығы әсер еткен кезде цитохром c оксидазасының белсенділігін сақтағанын көрсетті.

Бұл — оқшауланған жасушалар фармакологиясы. Қосылыс жасушаларға белгілі концентрацияда өсіру ортасы арқылы диффузиямен жеткен; оның жолында қасаң қабық, жас қабықшасы, көз бұршағы, шыны тәрізді дене, қанмен қамту немесе иммундық жүйе болмаған. Модельдің мақсаты да осы қарапайымдылықта: ол қосылыс ганглиозды жасушаларға жеткенде, сол жасушалардың өздерін қорғауға болатынын көрсетеді. Бірақ қасаң қабық бетіне тамызылған тамшы торлы қабықтың ішкі бөлігіне қандай да бір белгілі концентрацияны жеткізе ала ма деген сұраққа жауап бермейді. 10 micromolar-дан жоғары концентрациялар дәл осы жасушаларға уытты болғандықтан қолданылмаған. Бұл зертханалық ыдыста дозаға жауаптың екі бағытта да өзгеретінін еске салады.

Мутант тышқандардағы және жасуша желісіндегі фоторецепторлар

Үшінші зерттеу торлы қабықтың сыртқы бөлігіне қатысты. Зерттеушілер апоптозды қоздыратын фактор тапшылығы салдарынан I кешені толық құрастырылмайтын Harlequin тышқандарын пайдаланған және олар 11 айға толғанда фоторецепторлардың құрылымын, сыртқы сегмент маркерлерін және митохондриялардың тұтастығын тексерген. Метилен көгі енесінен ажыратылғаннан кейін ауыз су арқылы жүйелік жолмен, тәулігіне шамамен 10 mg/kg мөлшерінде берілген. Оны алған мутанттарда алмаған мутанттарға қарағанда торлы қабықтың қалыңдығы, родопсин мен опсин маркерлері жақсырақ сақталып, митохондрия құрылымы қалыпқа жақынырақ болған.

Қатар жүргізілген жасушалық жұмыста тышқан фоторецепторларына ұқсас, шексіз бөлінуге қабілетті 661W жасуша желісі пайдаланылған. Бұл жасушаларға 24 сағат бойы ротенон метилен көгімен бірге немесе онсыз әсер еткен. 30 micromolar концентрацияда тірі қалу жақсарған, ал төменірек концентрациялар NADH пен NAD+ арақатынасын қалыпқа келтіріп, тотығу стрессін азайтқан. Ерекше назар аударатын жайт — метилен көгінің жасамағаны: ол ATP-ті қалпына келтірмеген. Қорғаныс энергиямен қамтудың қалпына келуіне емес, тотығу-тотықсыздану стрессінің жеңілдеуіне және стресс жолдарының, соның ішінде митохондриядағы дұрыс қатталмаған ақуыздарға жауап пен митофагия маркерлерінің бәсеңдеуіне сәйкес келген.

Бұл айырмашылық метилен көгінің торлы қабыққа әсері туралы тұжырымдар үшін маңызды. Қосылыс стресс жағдайындағы фоторецепторды оның энергия тапшылығын түзетпей-ақ тірі сақтай алады. Сондықтан ықтимал емдік түсіндіру ауқымды жасаруға емес, тотығу-тотықсыздану стрессіне қатысты шектеледі.

Үш зерттеуді қатар салыстыру

Төмендегі салыстыруда әр зерттеудің моделі мен енгізу жолы көрсетілген, өйткені нәтиженің қандай қорытындыға негіз бола алатынын осы екі баған анықтайды.

Зерттеу	Модель	Метилен көгін енгізу жолы	Не сақталды
Zhang және әріптестері, тышқандағы оптикалық нейропатия	Ротенонмен зақымдалған тірі тышқанның торлы қабығы	Уытпен бірге шыны тәрізді денеге енгізілген	24 сағаттағы ганглиозды жасушалар қабатының қалыңдығы мен жасушалар саны
Daudt және әріптестері, егеуқұйрықтың бастапқы ганглиозды жасушалары	Өсіру ортасындағы оқшауланған ганглиозды жасушалар	Өсіру ортасында 1–10 micromolar концентрацияда ерітілген	Ротенон, стауроспорин және гипоксия әсеріндегі жасушалардың тірі қалуы
Mekala және әріптестері, Harlequin тышқандары мен 661W жасушалары	I кешеннің генетикалық ақауы және фоторецепторға ұқсас жасушалар	Ауыз суда тәулігіне 10 mg/kg; жасуша ортасында 30 micromolar	ATP қалпына келместен, фоторецептор құрылымы мен митохондрия тұтастығы

Әр жолда клиникаға дейінгі зерттеу берілген. Ешқайсысына пациенттер қатыспаған, көру көрсеткіштері өлшенбеген және офтальмологиялық препарат сыналмаған.

Неліктен бұл глаукоманы емдеу тәсілі емес

Глаукоманы емдеу көз ішілік қысымды төмендетуге бағытталған. Нейроқорғаныстың мақсаты басқа: стресс жағдайында ганглиозды жасушалар мен олардың аксондарын тірі сақтау. Жоғарыдағы зерттеулер бірінші емес, екінші бағытқа жатады. Олардың ешқайсысы қысымды төмендетпеген және ешқайсысында метилен көгі қысымды төмендететін еммен салыстырылмаған. Сондықтан глаукоманы емдеу мен қысымды бақылаудың қалыптасқан тәсілдері тотығу-тотықсыздануға негізделген нейроқорғаныстан бөлек мәселе болып қала береді, ал жасушалардың тірі қалуы туралы нәтижені көрудің сақталуы деп түсіндіруге болмайды.

Енгізу жолдарының айырмашылығы осыны одан әрі айқындайды. Шыны тәрізді денеге бірге енгізу зақым туындаған сәтте белгілі мөлшерді торлы қабықтың жанына жеткізеді. Ауыз су арқылы беру айлар бойы бүкіл жануарға әсер етеді, бірақ торлы қабықтағы концентрация белгісіз болады. Өсіру ортасы оқшауланған жасушаларға тікелей әсер етеді. Бұлардың ешқайсысы жергілікті қолданылған дозаның қандай бөлігі қасаң қабықтан өтіп, жас сұйықтығымен шайылып кетпей, көз бұршағы мен шыны тәрізді дене арқылы өтіп, торлы қабықтың қай қабатына пайдалы концентрацияда жететінін болжай алмайды. Бұл жеткізу мәселесі метилен көгінің енгізу жолдары мен таралуы туралы кеңірек сұрақтың бір бөлігі: әр жол үшін концентрацияны жеке өлшеу қажет.

Тіндердің айырмашылығы екінші кедергіні туғызады. Көздің алдыңғы бөлігіне жеткен бояғыш оның артқы бөлігіне жетті деген сөз емес, ал бір қабатқа пайдалы концентрация басқа қабатты зақымдауы мүмкін. Бөлшек саудадағы ерітінділер офтальмологиялық препараттарға қойылатын талаптар бойынша өндірілмейді, стерильденбейді, буферленбейді немесе консервіленбейді. Қасаң қабыққа және көз ішіне әсер ету кезінде тазалық, pH, осмолялдық және қосалқы заттардың бәрі маңызды. Торлы қабыққа қатысты бұл нәтижелердің ешқайсысы мұндай ерітінділерді көздің ішіне немесе бетіне қолдануды негіздемейді. Препаратты дайындау стандарттары туралы сұрақтар метилен көгінің қауіпсіздігі мен оны қолдану тәртібі аясында қарастырылуы тиіс.

Дәлелдердің шегі қайда

Үш мақаланы бірге қарастырғанда, олар тар ауқымды тұжырымды қолдайды: бақыланатын жағдайларда метилен көгі торлы қабық нейрондарындағы митохондриялық тотығу-тотықсыздану стрессін жеңілдетіп, олардың құрылымын сақтай алады. Осы жағдайлардың шегімен тұжырымның да шегі белгіленеді. Уытпен туғызылған және I кешеннің генетикалық ақауына негізделген модельдер глаукома, друзалар немесе диабеттік ауру емес. Қысқа бақылау кезеңдері мен құрылымдық соңғы көрсеткіштер көрудің ұзақ мерзім сақталуын білдірмейді. Ал бір бөліктегі қорғаныш концентрациясы басқа бөлік үшін доза бола алмайды.

Неғұрлым сенімді негіз үшін бірнеше бөлек дәлел қажет: клиникада қолдануға болатын енгізу жолынан кейін торлы қабыққа жететін мөлшердің анықталуы, жануарлардағы көру функциясының соңғы көрсеткіштері, глаукомаға қатысты модельде қысымнан тәуелсіз пайда, содан кейін адамдардағы қауіпсіздік пен тиімділік деректері. Бұлар пайда болғанға дейін метилен көгі мен көрудің байланысы шекарасы анық зерттеу гипотезасы болып қалады: торлы қабықтағы митохондриялық фармакологиялық әсері қисынды, бірақ тек жасушалар мен жануарларда көрсетілген және бұл зерттеулерден көзді емдеуге тікелей өтуге негіз жоқ.