Метилен көгі митохондриялық III кешенді айналып өте ала ма? Зерттеулер неліктен бір-біріне қайшы

Екі зертхана метилен көгі тежелген митохондриялық III кешенді айналып өте ала ма деген сұрақты зерттеді. Бірі «жоқ» деп жауап берді. Екіншісі «иә» деді. Екеуінің де деректері болды.

Тышқан миының митохондрияларына жүргізілген бірінші зерттеу бояғыштың мұны істей алмайтынын көрсетті. Кеміргіштердің үш түрінің ми митохондрияларына жүргізілген екінші зерттеу оның ішінара айналып өте алатынын анықтады. Тышқан бауырына жүргізілген үшінші зерттеу осы тақырыппен қатар жиі аталады, бірақ онда басқа нәрсе тексерілген. Оны өз аясында қарастырсаңыз, түсінбеушіліктің жартысы сейіледі.

Мұнда жариялауға болатын әмбебап механизм жоқ. Тежегіштері, дозалары және өлшенген көрсеткіштері әртүрлі үш тәжірибе бар. Алдымен жағдайларын оқыңыз. Қорытындылар содан шығады.

Мұнда айналып өту нені білдіреді

Электрондар тізбекке I кешен арқылы (NADH-тан) немесе II кешен арқылы (сукцинаттан) кіріп, III кешен арқылы цитохром c-ге, одан кейін IV кешен арқылы оттекке өтеді. Осы жолда қалыптасатын градиентті жасуша ATP өндіруге жұмсайды.

Айналып өту туралы тұжырым метилен көгінің электрондарды тежелген буынға дейін қабылдап, одан кейінгі буынға жеткізетінін білдіреді. Тотыққан бояғыш NADH-тан немесе тізбектің бастапқы компоненттерінен электрондарды қабылдап, лейкометилен көгіне айналады, ал тотықсызданған түрі оларды цитохром c-ге немесе қайтадан тізбекке береді. Егер электрондар тежелген буыннан кейін берілсе, тыныс алу мен мембраналық потенциал ішінара қалпына келеді. Егер олар тежелген буынның өзіне немесе оған дейін берілсе, ештеңе қалпына келмейді.

III кешеннің бір ерекшелігі осы даудың көп бөлігін айқындайды. Кешен тежегіш байланысатын екі орны бар Q циклін жүзеге асырады. Антимицин Qi орнына байланысады. Миксотиазол Qo орнына байланысады. Олардың біреуін ғана қолданған зерттеу кешеннің тек жартысын тексерген болады.

Бірінші зерттеу: тышқан миының митохондрияларында айналып өту жоқ

Gureev және әріптестері C57BL/6 тышқандарының ми қыртысынан дигитонинмен оқшауланған митохондрияларды пайдаланып, оларды ақуыз концентрациясы 0.1 mg per ml болған жағдайда зерттеді. Субстраттар үш режимді қамтыды: әрқайсысы 5 mM болатын пируват пен малат, 2 mM глутаматпен бірге 10 mM сукцинат және 10 mM L-пролин. Тежегіштер ретінде 1 micromolar ротенон (I кешен) және 1 microgram per ml антимицин (III кешен) қолданылды. Бояғыш дозалары 0.5, 1 және 2 micromolar болды, негізгі концентрациясы — 1 micromolar. Әдістер мен тіркелген қисықтар FEBS Letters журналындағы қысқаша мақалада берілген.

I кешенді айналып өту іске асты. Ротенон ADP ынталандыратын тыныс алуды шамамен 121-ден шамамен 2 nmol per minute per mg деңгейіне дейін төмендетті, ал 1 micromolar бояғыш оны шамамен 21-ге дейін қалпына келтірді. Пируват пен малатта және L-пролинде мембраналық потенциал қалпына келді.

III кешенді айналып өту іске аспады. Антимицин тыныс алуды шамамен 16-ға дейін төмендетті, ал бояғыш оны тек шамамен 20-ға дейін көтерді. Бояғыштың 5 micromolar-ға дейінгі дозаларында ешбір субстратта мембраналық потенциал қалпына келмеді. Пероксид деректері де осыны көрсетті: бояғыштың өзі пероксид бөлінуін бастапқы шамамен 76 pmol per minute per mg деңгейінен үш дозада тиісінше шамамен 1170, 1460 және 1945-ке дейін арттырды, бірақ антимицин бояғыш тудырған осы сигналды тиісінше шамамен 25, 88 және 96 percent төмендетті. Егер тотықсызданған бояғыш оттекпен тікелей әрекеттессе, III кешенді тежеу сигналды баспауы керек еді. Авторлар тотықсызданған бояғыш III кешеннің Qo орнында, антимицин тежейтін буынға дейін тотығады деген қорытынды жасады. Қысқа циклді сөзбен айтсақ: донорлардан бояғышқа, бояғыштан Qo-ға, одан әрі қалыпты жолмен. Ротенонның бөгеті айналып өтіледі. Антимициннің бөгеті айналып өтілмейді.

Екінші зерттеу: үш түрде, тежегіш байланысатын екі орында да ішінара айналып өту

Svab және әріптестері тәжірибе аясын кеңейтті. Тышқан, егеуқұйрық және теңіз шошқасы миынан Percoll көмегімен оқшауланған митохондриялар сол 0.1 mg per ml концентрациясында, әрқайсысы 5 mM болатын пируват пен малатта немесе глутамат пен малатта зерттелді. Олар III кешеннің екі тежегішін қолданды: 0.3 micromolar антимицин A және 1 micromolar миксотиазол. Көпшілік сынақта бояғыш концентрациясы 2 micromolar, ал цитохром c зерттеуінде 0.5 болды. Үш түрге де бірдей хаттамалар қолданылған тәжірибелер ашық қолжетімді мақалада берілген.

Үш түрдің бәрінде екі бөгет те ішінара айналып өтілді. Тышқан митохондрияларында антимицин тыныс алуды басып, бояғыш оны шамамен 60 percent арттырды: шамамен 37-ден 59 nmol per minute per mg деңгейіне дейін. Миксотиазол оны 88 percent төмендетіп, шамамен 4.5 деңгейіне жеткізді, ал бояғыш оны бес есе арттырып, шамамен 23-ке жеткізді. Екі тежегіштің кез келгені қолданылғанда мембраналық потенциал ішінара қалпына келді; оптикалық артефактілерді жоққа шығару үшін ол екі бояғышпен — сафранин O және ратиометриялық TMRM арқылы өлшенді.

Бұл мақалада электрондардың берілуі де тікелей тексерілді; бірінші зерттеу мұны мүлде жасамаған. Сырттан қосылған 25 micromolar ацетилденген цитохром c тежегіштер бар кезде де, жоқ кезде де энергияланған митохондриялармен тотықсызданбады, бірақ бояғыш қосу екі жағдайда да тотықсыздануды іске қосты. Жасушасыз буферде NADH пен бояғыш цитохром c-ні NADH мөлшеріне пропорционалды жылдамдықпен тотықсыздандырды. Ұзынырақ жолды сөзбен айтсақ: тотықсыздандырғыш эквиваленттерден бояғышқа, бояғыштан тікелей цитохром c-ге, IV кешеннен оттекке. Бұл жол III кешенді толығымен айналып өтеді, сондықтан екі тежегіштің де бөгетін айналып өтуге болады.

Қосымша екі көрсеткіш осы түсіндіруді қолдайды. Миксотиазолмен өңделген митохондрияларға бояғыш қосылғанда NAD(P)H флуоресценциясы төмендеді, яғни тотықсыздандырғыш эквиваленттер жаңа жол арқылы жұмсалды. Сондай-ақ бояғыштың 660 nm кезіндегі жұтылуы әр қосудан кейінгі өзгерісті көрсетті, ал центрифугалаудан кейінгі супернатанттар тотыққан бояғыштың энергияланған митохондриялардың ішінде жүз еседен астам жиналып, потенциал жойылғанда сыртқа шығатынын көрсетті. Протондар балансы да сәйкес келеді: протондарды айдайтын кезеңдерді өткізіп жіберу электрон жұбына шаққанда 10 орнына шамамен 2 протон қалдырады. Сондықтан оттектің жылдамырақ тұтынылуы мен потенциалдың тек ішінара қалпына келуі — нақты айналып өтудің көрінісі, оған қарсы дәлел емес.

Сол препарат үстірт түсіндіруге келмейтін жауаптар да көрсетті. Тежегіш пен бояғыш бірге болғанда ADP тыныс алуды арттырудың орнына төмендетті, ал тасымалды тежеу оны баяулатудың орнына ынталандырды; сонымен бірге мембраналық потенциал әлі де қалыпты бағыттарда өзгерді. Бұл жүйеде тек оттек тұтынуына сүйену жаңылыстырады.

Үшінші зерттеу: III емес, I және II кешендерді тексерген бауыр зерттеуі

Lee және Boelsterli эфавирензден (I кешен, IC50 шамамен 30 micromolar) және изониазид метаболиті гидразиннен (II кешен, IC50 шамамен 30 micromolar) зақымданған тышқан бауырының митохондриялары мен өсірілген гепатоциттерді пайдаланды. Шамамен 30 micromolar бояғыш NADH тотығуын, мембраналық потенциалды және ATP-ні қалпына келтіріп, тотықтырғыштар мен некроздық өлімді азайтты. Redox Biology журналындағы мақалада бұл бояғыштың электрондарды зақымданған I және II кешендерді айналып тасымалдауы ретінде модельденеді.

Бұл нәтиже тізбектің алдыңғы бөлігіндегі расталған жағдайды сипаттайды және III кешен туралы ештеңе айтпайды, өйткені онда ештеңе тежелмеген. Ол миға қатысты екі зерттеудің ешқайсысын растай да, теріске шығара да алмайды.

Жағдайлар матрицасы

III кешенге қатысты екі зерттеудің де өз жағдайлары үшін дұрыс болуының төрт себебі

1. Тежегіштің әсері бірдей болмады. Бір жағдайда тек 1 microgram per ml антимицин, екіншісінде 0.3 micromolar антимицин және бөлек Qo орнының тежегіші қолданылды. Электрондарды Qo орнына беретін бояғыш жолы тікелей цитохром c-ге беретін жол іске асатын жерде істемей қалады. Бір орын екеуінің орнына жүре алмайды.

2. Бояғыш дозасы мен уақыт айырмашылығы болды. Негізгі концентрациялар 1 және 2 micromolar болды; бұл тотығу-тотықсыздану циклдеріне қатысатын заттың сіңуі мен цитохром c-ні тікелей тотықсыздандыруы концентрацияға және уақытқа тәуелді. Дозадағы шағын айырмашылықтар мен өлшеу уақытының өзгешелігі бір желінің әртүрлі тармақтарын көрсете алады.

3. Препараттарды дайындау тәсілдері әртүрлі болды. Дигитонинмен оқшаулау және Percoll градиентінде оқшаулау бір-бірімен ішінара сәйкес келетін, бірақ бірдей емес митохондриялық популяцияларды бөліп алады. Ақуыз концентрациясы екі жағдайда да 0.1 mg per ml болды, сондықтан бұл айнымалы есептен шығады, бірақ субпопуляция мен бүтіндік мәселесі қалады. Ал айырмашылықтың түрге байланысты болуы жоққа шығарылды: екінші топ өз нәтижесін тышқанда да қайталады.

4. Субстрат жағдайы бояғыштың не істей алатынын анықтайды. Бір жағында үш субстрат режимі, екінші жағында NADH-пен байланысты жұптар болды. NADH қоры мен мембраналық потенциал бірге бояғыштың қаншалықты жылдам тотықсызданатынын және қайда таралатынын анықтайды; ал тотыққан цитохром c жанында тотықсызданған бояғышты қажет ететін жол осы таңдауға тәуелді.

Айналып өту туралы келесі тұжырымды қалай оқу керек

Қай кешеннің, қай тежегішпен, қай орында және қандай дозада тежелгенін сұраңыз. Бояғыш концентрациясы қандай болғанын және көрсеткіш қашан өлшенгенін сұраңыз. Тінді, түрді, оқшаулау тәсілін, ақуыз концентрациясын және субстратты анықтаңыз. Сондай-ақ потенциал, тыныс алу, тотығу-тотықсыздану күйі және электрондардың тікелей берілуін тексеретін сынақ бір-бірімен сәйкес келе ме деп сұраңыз, өйткені мұнда тек оттек тұтынуына сүйену бірнеше рет қате қорытындыға жетеледі.

Шектеулі қорытынды өз күшінде қалады. Бояғыштың I кешенді айналып өтуі жөнінде келісім бар. III кешенге келсек, 1 microgram per ml антимицин және 1 micromolar бояғыш қолданылған тышқан митохондриялары функционалдық айналып өтуді көрсетпейді. Ал 0.3 micromolar антимицин немесе 1 micromolar миксотиазол және 2 micromolar бояғыш қолданылған үш түрдің митохондриялары бояғыштан цитохром c-ге тікелей электрон берумен бірге ішінара айналып өтуді көрсетеді. Бұл тұжырымдар бір-біріне қайшы емес. Бұдан кеңірек кез келген қорытынды — экстраполяция.

Қосымша материалдар даулы тұжырымды даусыз химия аясында қарастыруға көмектеседі: электрондарды кезекпен беру туралы метилен көгі электрондарды қалай тасымалдайды, тізбектің алдыңғы бөлігіндегі расталған жағдай туралы I кешенді айналып өту тәжірибелері, екі бояғыштың неге қажет болғаны туралы мембраналық потенциалды өлшеу нәтижелері және олардың артефактілері, сондай-ақ доза мен уақытқа қатысты қателіктерді түсіну үшін тотығу-тотықсыздану циклдеріне қатысатын заттармен зертханада жұмыс істеу.