Метилен көгі және ферроптоз: липидтердің пероксидтік тотығу механизмі

Ферроптоз — мембрананың зақымдануынан болатын жасуша өлімі. Мембранадағы полиқанықпаған майлар тізбекті реакция арқылы тотығады, мембрана өз қызметін атқара алмай қалады да, жасуша өледі. Бұл химиялық үдеріске темір қажет. Осы сөйлем тұтас ұғымды қамтиды, ал мақаладағының бәрі оның белгілі бір бөлігін тексереді.

Мұнда қойылатын сұрақ нақтырақ: жасушалық тәжірибелерде метилен көгі осы тізбекке қалай әсер етеді және алынған нәтиже шын мәнінде нені көрсетеді? Қысқаша жауап: екі зертханалық зерттеуде наномолярлық концентрациядағы метилен көгі митохондриялық липидтердің пероксидтік тотығуын азайтып, әдетте ферроптоз туғызатын әсерлерден кейін жасушаларды тірі сақтаған. Толық жауап маңыздырақ, өйткені тізбектің әр буыны әртүрлі араласу арқылы тексерілген және әр араласудың өз шектеулері бар.

Бір абзацтағы ферроптоз

Құрамында полиқанықпаған май қышқылының құйрығы бар мембраналық фосфолипидтің осал тұсы болады: одан сутек атомдарын оңай жұлып алуға болады. Радикал олардың бірін жұлып алғаннан кейін липидке оттек қосылады, липидтік пероксил радикалы түзіледі, ал ол келесі липидтен сутекті жұлып алады. Бір нәрсе тоқтатпаса, реакция мембрана бойымен тарала береді.

Негізгі тежеуші — GPX4 деп аталатын фермент. Ол глутатионды пайдаланып, липидтік пероксидтерді зиянсыз липидтік спирттерге дейін тотықсыздандырады. Зертханалық қоздырғыштар осы қорғаныстың нақты буындарына әсер етеді. Эрастин xc-minus жүйесі арқылы цистиннің жасушаға енуін бөгейді, соның салдарынан глутатион синтезіне қажет цистеин жетіспейді. Бутионин сульфоксимин глутатион синтезін тікелей бөгейді. RSL3 GPX4-тің өзін тежейді. Үшеуі де пероксидтердің жойылмай қалуына әкеледі, бірақ әртүрлі кезеңге әсер етеді. Сондықтан бір қоздырғышпен алынған нәтижені басқаларына автоматты түрде қолдануға болмайды.

Ферроптоз апоптоздан оны анықтайтын белгілері бойынша ерекшеленеді. Онда каспазалық каскад та, апоптоздық денешіктер де болмайды. Дефероксамин сияқты темір хелаторлары және ферростатин-1 сияқты радикалдарды ұстап қалатын заттар оны басады. Зерттеушілер жасуша өлімін жай некроз емес, ферроптоз деп тану үшін осы тәжірибелік өлшемді қолданады. Реттелетін жасуша өлімінің басқа жолдарын кеңірек қарастыру бұл айырмашылықты түсінуге көмектеседі, ал жасушалардың лабильді темірді қалай реттейтіні хелаттаудың неліктен соншалықты шешуші бақылау тәсілі екенін түсіндіреді.

Митохондриялардың орны және бұл мәселенің неге даулы болғаны

Алғашқы жұмыстарда митохондриялық ДНҚ-сы жоқ жасушалардың да ферроптозға ұшырайтыны хабарланған. Бұл митохондриялардың міндетті түрде қажет емес екенін меңзеген. Кейінгі жұмыстар митохондриялардың санын азайту немесе тыныс алуды бөгеу цистеин тапшылығынан туындайтын ферроптозды баса алатынын, бірақ GPX4-ті тікелей тежеуден болатын ферроптозды баспайтынын анықтады. Егер митохондриялардың үлесі қоздырғышқа, жасуша түріне және шешуші пероксидтік тотығудың қай жерде жүретініне тәуелді болса, екі нәтиже де дұрыс болуы мүмкін.

Осы мақаланың негізін құрайтын зерттеу даулы мәселені белгілі бір жасушалық бөлімге бағытталған зонд арқылы қарастырды. MitoCLox — липидтердің пероксидтік тотығуын көрсететін индикатордың митохондрияларға бағытталған нұсқасы: митохондрия ішіндегі липидтік пероксил радикалдарымен кездескенде оның флуоресценциясы өзгереді. Эрастинмен өңделген фибробласттарда митохондриялық зондтың тотығуы әлі тірі жасушаларда, өлімге дейін байқалған және жасушалар популяциясында біркелкі болмаған. Бұл уақыт реттілігі маңызды. Өлімге дейін жүретін пероксидтік тотығу оның ықтимал себебі болуы мүмкін. Тек өлі жасушаларда өлшенген пероксидтік тотығу — ыдырау қалдықтарының белгісі. Липидтердің пероксидтік тотығуын анықтау әдістері және әр зонд нені көрсететіні туралы қосымша нұсқаулық зондтың орналасуы сигналдың мағынасын неліктен анықтайтынын түсіндіреді.

Дәл осындай көрініс екінші модельде де байқалды. Лебердің тұқым қуалайтын оптикалық нейропатиясы бар науқастан алынған, I кешенінде мутациясы және бастапқы тотығу стрессі жоғары фибробласттар глутатион азайғанда ферроптоздан өлген, ал бақылау фибробласттары төзімді болған. Митохондриялық зондтың тотығуы бұл жолы да алдымен байқалған. Толық мәлімет фибробласттардағы ферроптоз кезіндегі митохондриялық липидтердің пероксидтік тотығуын зерттеген жұмыста берілген.

Осы тәжірибелерде метилен көгі нені өзгертті

Метилен көгі — тотығу-тотықсыздану тасымалдаушысы. Оның тотыққан түрі I кешеніндегі NADH-пен байланысты реакциялардан электрондарды қабылдайды, ал тотықсызданған түрі оларды IV кешеніне жеткізетін c цитохромына береді. Бұл электрондар әдетте оттекке өтіп, супероксид түзетін тізбек бөлігін ішінара айналып өтетін жол жасайды. Электрондарды берудің толық көрінісін білгісі келетін оқырмандар метилен көгінің митохондриялар арқылы электрондарды қалай тасымалдайтынынан бастағаны жөн.

Эрастинмен өңделген өкпе фибробласттарында 250 наномолярлық концентрациядағы метилен көгі митохондрияларға бағытталған SkQ1 және MitoTEMPO антиоксиданттары сияқты, жасушалардың тіршілігін бағалау сынағында олардың өміршеңдігін сақтаған. Тұжырымның шегін бақылау жағдайлары анықтайды. Ферростатин-1, альфа-токоферол және дефероксамин де қорғаныс көрсеткен, бұл өлімнің ферроптоздық болғанын растайды. Антиоксиданттық тобы жоқ SkQ1 аналогы қорғамаған: бұл бейспецификалық жиналуға емес, тотығу-тотықсыздану реакцияларына меңзейді. SkQ1 концентрациясы шамамен 200 наномолярдан асқанда қорғаныс әлсіреген. Бұл хинондық антиоксиданттардың мөлшері жоғары болғанда байқалатын белгілі прооксиданттық қасиетіне сәйкес келеді. Метилен көгінің де дозаға байланысты осындай екіжақты әсері бар: осы жасуша дақылдарында төмен наномолярлық деңгейлерде ол қорғайды, ал концентрациясы артқанда немесе күшті жарық түскенде тотығу-тотықсыздану циклі арқылы сутек пероксидін түзе алады. Дозаға қатысты осындай мәнмәтін митохондриялардағы оттектің реактивті түрлері туралы мақалада қарастырылған.

Одан кейін оқшауланған митохондриялармен жасалған тәжірибелер ROS көздерін ажыратты. Екі валентті темір бар кезде I кешенін қамтамасыз ететін субстраттар мен ротенон зондтың тотығуын күшейткен. Ротенон флавиндік орталықтан кейінгі электрон тасымалын бөгейді, сондықтан оған дейінгі тасымалдаушылар тотықсызданған күйде қалып, матрикске қараған флавиннен электрондар оттекке өтеді. III кешенін қамтамасыз ететін субстраттар мен антимицин A көп мөлшерде сутек пероксидін түзгенімен, липидтердің пероксидтік тотығуын туғызбаған. Жалпы ROS сигналы бірдей, бірақ орны да, нәтижесі де басқа. SkQ1 мен метилен көгінің әрқайсысы сутек пероксидінің түзілуін баспай-ақ, I кешені туғызған пероксидтік тотығуды басқан. Бұл олардың ROS түзілгеннен кейін, липидтердің пероксидтік тотығуы кезеңінде әсер ететінін көрсетеді.

Темірдің шамадан тыс жүктемесін зерттеу және липофусциннің ишарасы

Екінші зерттеу мәселені темір тұрғысынан қарастырды. Субмиллимолярлық концентрациядағы үш валентті темірдің аммоний цитраты әсер еткен H9c2 кардиомиоциттерінде алдымен митохондриялық ROS, содан кейін митохондриялық липидтердің пероксидтік тотығуы және ферроптоз пайда болған, ал 24 сағат ішінде липофусцинге ұқсас пигмент жиналған. Липофусцин — жас ұлғайған сайын жиналатын, құрамында темірі бар, тотыққан липидтер мен ақуыздардың автофлуоресцентті қалдығы. Оның мұнда тез пайда болуы темір туғызған жедел пероксидтік тотығуды қартаюдың классикалық маркерімен байланыстырады. Наномолярлық концентрациядағы метилен көгі мен SkQ1-дің әрқайсысы пероксидтік тотығуды, жасуша өлімін және пигменттің жиналуын болдырмаған. Оқшауланған жүрек митохондриялары осы заңдылықты растаған: ротенон мен екі валентті темір пероксидтік тотығуды және пигментке ұқсас сигналды туғызған, ал екі зат та оны бөгеген. Толық реттілік H9c2 кардиомиоциттеріндегі темірдің шамадан тыс жүктемесін зерттеген жұмыста баяндалған. Бұл құбылыстың пигментке қатысты жағы липофусцин және жасушалық қартаю маркерлері тақырыбымен байланысты.

Жасушалардың тіршілігін бағалау сынақтары нені көрсетпейді

CellTiterBlue сияқты өміршеңдік сынағы қоздырғыш пен ықтимал қорғаныш зат бірге қолданылғаннан кейін дақыл ыдысында қанша жасушаның метаболизмдік белсенділігі сақталғанын көрсетеді. Бұл — нақты анықталған жүйедегі механизмді тексеру. Бұл емдеу нәтижесі емес. Осы тәжірибелердің ешқайсысында науқасқа зат енгізілмеген, ауруға қатысты түпкі нәтиже өлшенбеген немесе ағзадағы терапиялық терезе анықталмаған.

Төрт шектеуді ашық айту керек. Біріншіден, жасуша түрлерінің ауқымы тар: трансформацияланған өкпе фибробласттары, митохондриялық ауруы бар бір жасуша желісін қамтитын бастапқы тері фибробласттары, егеуқұйрық кардиомиоциттерінің желісі және оқшауланған егеуқұйрық жүрегінің митохондриялары. Сезімталдық жасуша желісіне қарай өзгерген, ал LHON желісі әдейі ерекше осалдығына байланысты таңдалған. Екіншіден, қоздырғыштар зертханалық шектен тыс жағдайларды туғызады: тасымалдың немесе синтездің толық бөгелуі және ешбір тін жедел жағдайда ұшырамайтын темір жүктемелері. Үшіншіден, концентрацияны жай көбейту арқылы басқа жағдайға көшіруге болмайды. Дақыл ортасындағы наномолярлық концентрация адамға берілетін доза емес. Дақыл ыдысы мен адам ағзасының арасындағы айырмашылықтарға метилен көгінің таралуы, қан мен тінде түссіз түріне дейін тотықсыздануы, жарық әсері және мембраналық потенциал жатады. Төртіншіден, зондтар тек өздері орналасқан бөлімдегі жағдайды көрсетеді. MitoCLox тотығуы митохондриялық липид радикалдарының түзілгенін көрсетеді; ол ықтимал соңғы оқиға — плазмалық мембрананың жарылуы — алдыңғы кезеңдердегі әсер арқылы айналып өтілді ме, әлде тікелей болдырылмады ма, оны көрсетпейді.

Сондықтан дәлелге сай тұжырым мынадай: осы модельдерде I кешенінен түзілген ROS пен темір ферроптоздан бұрын жүретін митохондриялық липидтердің пероксидтік тотығуын туғызады, ал төмен концентрациядағы метилен көгі осы бөлікті үзеді. Осы бөліктен тыс кез келген қорытынды үшін алдымен жануарларда, содан кейін адамдарда басқа тәжірибелер қажет.