Мақала
Метилен көгі антиоксидант және прооксидант ретінде: нәтижені не өзгертеді?
Екі зертхана бір көк бояғышты сынап, бір-біріне қарама-қайшы нәтижелер туралы хабарлады делік. Біріншісінде оқшауланған ми митохондрияларының тыныс алуы жақсарып, ATP көбірек түзіледі. Екіншісінде дәл сол препарат әлдеқайда көп сутек пероксидін бөледі. Екі есеп те дұрыс. Олар бір циклді екі жағынан сипаттайды, ал түсінбеушілік оқырман бір жағын бүкіл құбылыс деп қабылдағанда басталады.
Қателік — молекулаға қай атау сәйкес келетінін сұрау. Метилен көгі электрондарды тасымалдаушы буын ретінде әрекет етеді; мұны кеңірек контексте оның жасуша биологиясындағы нысаналарының картасы көрсетеді. Тотыққан бояғыш электрондарды қабылдап, түссіз leucoMB-ге айналады. LeucoMB сол электрондарды әрі қарай беріп, қайта көгереді. Байқалатын нәтиже электрондарды кім беретініне, кім қабылдайтынына және жүйе осы үдерісте түзілген сутек пероксидін жоя алатынына байланысты. Қойылуға тиіс сұрақ ешқашан бояғыштың антиоксидант екені туралы емес. Ол — берілген жағдайларда осы тасымалдаушы буынның не істей алатыны туралы.
Екі қырды да туғызатын цикл
Қараңғыда негізгі цикл қысқа. NADH, NADPH немесе тыныс алу тізбегіндегі тасымалдаушылар бояғышты тотықсыздандырады. Одан кейін тотықсызданған бояғыштың бір-бірімен бәсекелес бірнеше жолы бар. Ол электрондарды c цитохромына беріп, зақымданған кешенді айналып өтетін ағынды қолдай алады; сондықтан I немесе III кешен тежелгенде тыныс алу мен мембраналық потенциал ішінара қалпына келеді. Немесе ол электрондарды тікелей оттекке бере алады: бұл көк форманы қайта түзіп, сутек пероксидін өндіреді. Бояғыш қайта түзілетіндіктен, оның аз мөлшері осы циклді көп рет қайталап, тотықсыздандырғыш эквиваленттерді үздіксіз жұмсайды және пероксидті үздіксіз түзеді.
Тағы екі тармақ химиялық үдерісті түбегейлі өзгертеді. Бос мыс немесе темір Фентон типті реакциялар арқылы сол диффузияланатын пероксидті әлдеқайда жойқын жергілікті тотықтырғыштарға айналдырады. Қызыл жарық жеке фотохимиялық тармақты іске қосады: мұнда қозған бояғыш энергияны оттекке беріп, синглетті оттек түзеді. Бұл түр I және II типті фотохимия түсіндірмесінде егжей-тегжейлі қарастырылған. Қараңғыдағы тотығу-тотықсыздану циклі, металдар күшейтетін зақымдану және фотодинамикалық зақымдану — бастапқы молекуласы ғана ортақ үш түрлі механизм.
Жағдай мен нәтиже матрицасы
Төмендегі кестені негізгі анықтамалық ретінде сақтауға болады. Әр жолда бір айнымалы, оның нәтижені қай бағытқа өзгертетіні және соны көрсеткен тәжірибе берілген. Оң бағыт қорғаныш әсерін немесе көрсеткіштің жақсаруын білдіреді. Теріс бағыт тотықтырғыштың көбеюін, қорлардың көбірек сарқылуын немесе зақымданудың күшеюін білдіреді.
| Жағдай | Нәтиженің бағыты | Тәжірибе нені көрсетті |
|---|---|---|
| Төмен концентрация, 0.1–1 uM, оқшауланған митохондриялар | Биоэнергетиканың жақсаруы және пероксидтің артуы | 0.1 uM сау және диабеті бар егеуқұйрықтардың жүрек митохондрияларында оттек тұтынуды жақсартты; 100 nM–1 uM тежелген ми митохондрияларында ATP, мембраналық потенциал және кальций сіңірілуін ішінара қалпына келтірді, ал пероксид бөлінуі барлық жағдайда артты |
| Жоғарырақ концентрация, 5 uM-ден жоғары, глюкозасыз жасушалар | Тотықтырғыш сигналының жағымсыз артуы | Глюкоза болмаған кезде 5 uM-ден жоғары концентрацияда эндотелий жасушалары жалпы ROS зондын тотықтырды және тотықсызданған глутатион қорын жоғалтты; глюкоза қосу екеуінің де алдын алды |
| I кешеннің субстраттары (глутамат пен малат) | Пероксидтің көбеюі | Ми және жүрек митохондрияларына жүргізілген зерттеулердің екеуінде де NADH-пен байланысты субстраттар кезінде пероксид бөлінуінің артқаны анықталды |
| Сукцинат пен ротенон, жүрек митохондриялары, 0.1 uM | Осы хаттамада пероксидтің азаюы | Осы зерттеулер жиынтығындағы пероксид бойынша айқын антиоксиданттық нәтиже көрсеткен жалғыз жағдай; хаттамада ротенон да болғанын және басқа тін қолданылғанын ескеріңіз, сондықтан мұны тек субстратпен түсіндіруге болмайды |
| Қызыл жарық, 20 uM және 630 nm | ДНҚ-ның жағымсыз зақымдануы | Қараңғыда 20 uM кезінде митохондриялық ДНҚ-ның елеулі зақымдануы болмады; дәл сол концентрация қызыл жарықпен бірге тексерілген барлық фрагментті зақымдады |
| Қараңғыдағы өте жоғары концентрация, 100 uM | ДНҚ-ның жағымсыз таңдамалы зақымдануы | Пуринге бай тізбектерде митохондриялық ДНҚ-ның таңдамалы зақымдануы байқалды; бұл наномолярлық пероксид сигналынан сапалық тұрғыдан өзгеше құбылыс |
| Мыс немесе темір және NADH, жасушасыз ортадағы ДНҚ | Жағымсыз тотығу зақымдары | Мыс зақымды p53-тің жиі зақымданатын тізбегіне бағыттады; темір–EDTA кең ауқымды зақым туғызды; каталаза мен металл хелаторлары тиісті жолдарды бөгеді; тотыққан гуанин мөлшері артты |
| Глюкоза бар, бүтін жасушалар | Цикл жылдамдаса да, қорғаныштық буферлеу сақталды | Глюкоза бояғыштың тотықсыздануын арттырды, бірақ жалпы күйзелісті азайтты; бұл антиоксиданттарды қайта қалпына келтіру үшін пентозофосфат жолының NADPH беруімен үйлеседі |
| Аскорбатпен байытылған жасушалар | Аралас: аскорбат жұмсалды, зонд сигналы бәсеңдеді | Бояғыш глюкоза бар кезде де жасушаішілік аскорбатты біртіндеп тотықтырды, сонымен қатар зондтың тотығуын ішінара басып отырды; шығын қорғаныш қоры есебінен өтелді |
| Бояғыш алдымен беріліп, кейін ротенон әсеріне ұшыраған жануарлар | Тін деңгейіндегі оң нәтиже | Бояғышты алдын ала беру оқшауланған митохондрияларда пероксидті арттырғанына қарамастан, тышқанның ортаңғы миында ротенон туғызған митохондриялық ДНҚ зақымдарын азайтты |
Негізгі мән — жолдар арасындағы ортақ заңдылықта. Пероксид түзілуі мен биологиялық қорғаныс — бөлек өлшемдер. Бір әсер біріншісі бойынша жағымсыз, ал екіншісі бойынша оң нәтиже бере алады.
Неліктен бір доза әртүрлі жауап береді
Концентрация электрон тасымалдау мүмкіндігін белгілейді, бірақ ақырғы нәтижені анықтамайды. Бүтін ми митохондрияларына жүргізілген зерттеуде ми митохондрияларынан пероксид бөлінуі 50 nM-ден бастап анық байқалатындай артты, ал қараңғыда митохондриялық ДНҚ-ның айқын зақымдануы үшін 100 uM қажет болды. Алғашқы сигнал мен геноуыттылық арасындағы айырма шамамен екі мың есе, бірақ бұл қауіпсіздік қоры емес. Соңғы көрсеткіштер, жасушалық бөлімдер және әсер ету уақыты әртүрлі, сондықтан сандар бір қисықтағы нүктелерді емес, бөлек құбылыстарды білдіреді. Дозаға жауапты талқылау төмен деңгейдегі сигнал мен жоғары деңгейдегі зақым арасындағы осындай алшақтықты гормезистің кеңірек контексінде қарастырады.
Субстрат электрондардың қай жерден кіретінін анықтайды. NADH-пен байланысты энергия көздері бояғышты пайдалы айналма жолға да, оттекпен тиімсіз реакцияға да жеткілікті тотықсыздандырғыш эквиваленттермен қамтамасыз етеді. Сукцинат бояғышты антиоксидантқа, ал глутамат прооксидантқа айналдырады деген жиі айтылатын қорытынды деректерден артық тұжырым жасайды. Себебі жүрек зерттеуіндегі сукцинатпен пероксид өлшенген жағдайда ротенон да болған, әрі барлық субстраттар мен тыныс алу күйлерінде пероксидтің артқанын анықтаған ми зерттеуінен өзгеше тін мен доза қолданылған.
Жарық тек әсердің шамасын емес, механизмнің өзін өзгертеді. Осы зерттеулердегі ең айқын салыстыру: қараңғыдағы 20 uM митохондриялық ДНҚ фрагменттерінде анықталатын өзгеріс туғызбаған, ал қызыл жарықтағы 20 uM олардың барлығын зақымдаған. Жарықтағы тәжірибені қараңғыдағы тәжірибемен салыстырған адам фотохимияны тотығу-тотықсыздану циклімен салыстырып отыр.
Металдар тотықтырғышты өзгертеді. Металдар болмаса, бояғыштың қараңғыдағы циклі пероксид түзеді; бұл — диффузияланатын және жасушалар сигнал ретінде де пайдаланатын молекула. Қолжетімді мыс немесе темір болғанда, NADH тотықсыздандырған бояғыш металдың тотықсыздануын қамтамасыз етеді, ал тотықсызданған металл ДНҚ маңында пероксидті гидроксил типті бөлшектерге немесе мыс-пероксид бөлшектеріне айналдырады. NADH және металл иондарымен жүргізілген жасушасыз зерттеу бір бастапқы бояғыштан белгілі бір аймақтарға бағытталған және кең ауқымды ДНҚ зақымдарын осылай туғызды. Бұл тармақтың маңызды болатынын бояғыштың өзі ғана емес, сол бөлімдегі металдардың реттелуі анықтайды.
Энергия көздерінің күйі жасушаның шығынды өтей алатынын анықтайды. 2–20 uM бояғыш әсеріне ұшыраған эндотелий жасушаларында глюкозаны алып тастау тотықтырғышқа байланысты шығынды айқын көрсетті, ал глюкозамен қамтамасыз ету оны жойды, тіпті глюкоза бояғыштың тотықсыздануын да жеделдетсе де. Қорғаныш қорлары қамтамасыз етілген жылдам цикл қорлары сарқылған баяу циклден тиімдірек. Глюкоза немесе NADPH күйі көрсетілмеген кез келген тотықтырғыш туралы тұжырымды толық емес деп қабылдаңыз.
Тін қолда бар биологиялық тетіктерді анықтайды. Эндотелий жасушалары глюкоза метаболизмі арқылы NADPH-ты қайта түзеді және цитозольдік антиоксидант қорларына ие. Оқшауланған митохондрияларда мұның ешқайсысы жоқ. Тазартылған ДНҚ-да тіпті қалпына келтіру жүйесі де жоқ. Бір препараттағы нәтиже басқалар туралы аз ғана мәлімет береді, сондықтан тінге тән жауаптар жөніндегі жоспарланған мақалада бұл жүйелерді бөлек қарастыру қажет болады.
Тікелей өлшеу кейінгі қорғаныш жауабымен бірдей емес
Көптеген мәтіндер тәжірибелер бөлек қарастыратын екі деңгейді біріктіріп жібереді. Бір деңгей қанша тотықтырғыш пайда болғанын сұрайды. Екіншісі жасушаның қалай жауап бергенін сұрайды.
Amplex типті пероксид талдаулары бірінші деңгейге ең жақын, бірақ олардың өзі таза ағынды көрсетеді: түзілу мөлшерінен ыдырау мен сыртқа шығарылу мөлшерін шегергендегі нәтиже. Ми митохондрияларын зерттеу екі жақтағы өзгерісті де анықтады: пероксид көбірек түзілген және қосылған пероксидтің бір реттік мөлшері баяуырақ жойылған. Одан кейінгі сатыларда глутатионның тотығуы, аскорбаттың жұмсалуы, тотыққан гуанин және полимераза жұмысын бөгейтін ДНҚ зақымдары орналасады. Әр саты тотықтырғыш пен өлшенетін көрсеткіштің арасына қосымша биологиялық үдерістерді енгізеді.
Nrf2 арқылы реттелетін антиоксидант ферменттер мен митохондриялық биогенез екінші деңгейге жатады. Бұлар — пероксидтің әлсіз импульсі іске қоса алатын бейімделу бағдарламалары. Ми митохондрияларын қорғау зерттеуінің авторлары дәл осы әлсіз күйзелісті іске қосушы фактор ретінде ұсынады, сонымен бірге Nrf2 арқылы өтетін себеп-салдар тізбегі өздерінің толық дәлелдеуіне емес, бұрынғы жұмыстарға сүйенетінін атап көрсетеді. Жаңа ақуыздар арқылы бірнеше сағаттан кейін пайда болатын қорғаныс бастапқы химиялық үдеріс антиоксиданттық болды дегенді білдірмейді. Бұл шағын прооксиданттық оқиғаның күштірек қорғаныш жауабын іске қосқанын білдіреді. Мұндай тұжырымдарды бағалаудың сақтық қағидалары, соның ішінде талдау әдістерінің шектеулері мен препараттар арасындағы айырмашылықтар, метилен көгі туралы зерттеулерді оқу нұсқаулығында қарастырылады.
Неліктен талдау әдістері бір-біріне сәйкес келмейді
Дигидрофлуоресцеин сияқты жалпы зонд пероксид концентрациясын емес, зондтың жалпы тотығуын көрсетеді. Ол пероксидаза мен гем химиясына тәуелді және калибрленген Amplex талдауы анықтайтын пероксид өсімін байқамай қалуы мүмкін. Ми митохондриялары зерттеуінде пероксид күрт артқанымен, соған сәйкес супероксид сигналы байқалмаған; бұл бояғышқа негізделген жалғыз өлшеуге сүйеніп антиоксиданттық әсер туралы тұжырым келтіруден сақтандырады. Оптикалық қабаттасу — орынды бақылау мәселесі, өйткені бояғыш жиі қолданылатын қоздыру және сәуле шығару жолақтарына жақын көрінетін жарықты жұтады. Алайда мұқият жүргізілген зерттеуде белгілі пероксид мөлшерлерімен калибрлеу жасалған, қоздыру жарығының әсері азайтылғанда сигнал шамалы ғана өзгерген және пероксидтің баяуырақ жойылуы бөлек электродпен расталған. Кедергі ықпалын тексеру қажет, бірақ ол нәтижені автоматты түрде жоққа шығаруға негіз емес.
Кальцийге қатысты нәтиже де дәл осындай нақтылықтың қажеттігін көрсетеді. Жүрек зерттеуінде бояғыштың қысқа мерзімді әсері өткізгіштіктің ауысуына дейінгі жалпы кальций жүктемесін өзгертпеген, бірақ диабетке бағытталған жүрек митохондриялары зерттеуінде тежелген ми митохондрияларында кальций сіңірілу жылдамдығын жақсартқан. Соңғы көрсеткіштер де, жүйелер де әртүрлі — қайшылық жоқ.
Қорытындыға сенер алдында тексерілетін тізім
Антиоксиданттық немесе прооксиданттық әсер туралы әрбір қорытындыны белгілі бір жүйе жөніндегі есеп деп қабылдап, бес сұрақ қойыңыз. Қандай концентрацияда және қай бөлімде? Қай электрон донорымен және қай бәсекелес акцептормен? Жарықта ма, әлде қараңғыда ма, қандай толқын ұзындығы мен дозада? Қандай металдар қолжетімді, энергия көздері мен антиоксидант қорлары қаншалықты қамтамасыз етілген? Қандай талдау әдісі қолданылған және ол тотықтырғыш ағынын, зақымды әлде бейімделу жауабын өлшей ме? Осы жауаптардың кез келгенін өзгертсеңіз, сол молекула матрицада қорғаныштан зақымдаушы әсерге ешқандай парадокссыз ауыса алады.