მეთილენის ლურჯის ალტერნატივები მიკროსკოპიისთვის: აირჩიეთ ამოცანის მიხედვით

მარტივი ბაქტერიული ნაცხისთვის მეთილენის ლურჯი შეიძლება კრისტალური იისფერით ჩანაცვლდეს, როდესაც მიზანი უჯრედის ფორმის დანახვაა. ცოცხალი უჯრედებისთვის უკეთესი ალტერნატივა შეიძლება საერთოდ შეუღებავი ფაზურ-კონტრასტული მიკროსკოპია იყოს. არჩევანი დამოკიდებულია იმაზე, თუ რა დაკვირვება გჭირდებათ.

წარმოიდგინეთ, რომ ორი ადამიანი ერთსა და იმავე ბაქტერიულ კულტურას იკვლევს. ერთს უნდა ღეროსებრი უჯრედები მრგვალი უჯრედებისგან განასხვაოს. მეორეს სურს გაიგოს, მოკლა თუ არა ბაქტერიები გარკვეულმა დამუშავებამ. საღებავმა, რომელიც პირველ ადამიანს მკაფიო გამოსახულებას აძლევს, მეორეს შეიძლება გამოსადეგი პასუხი საერთოდ ვერ მისცეს.

შემცვლელის არჩევამდე დაასრულეთ ეს წინადადება: „მე უნდა დავაკვირდე ___-ს ___-ში, და უჯრედები უნდა / არ არის აუცილებელი დარჩეს ცოცხალი.“ ეს წინადადება განსაზღვრავს ამოცანას, რომელიც საღებავმა უნდა შეასრულოს.

დაიწყეთ ნიმუშითა და კითხვით

ჯერ განსაზღვრეთ, უნდა დარჩეს თუ არა უჯრედები ცოცხალი, შემდეგ კი დაადგინეთ, რომელ მახასიათებელზე გჭირდებათ დაკვირვება:

• უჯრედები უნდა დარჩეს ცოცხალი: მოძრაობის ან ფორმის დასაკვირვებლად განიხილეთ შეუღებავი ფაზური კონტრასტი ან DIC; ბირთვული DNA-სთვის განიხილეთ Hoechst 33342 ფლუორესცენციით; მემბრანის მთლიანობისთვის აირჩიეთ ვალიდირებული ანალიზი, როგორიცაა SYTO 9 პროპიდიუმის იოდიდთან ერთად.
• უჯრედების ცოცხლად დარჩენა აუცილებელი არ არის: ბაქტერიული მორფოლოგიისთვის განიხილეთ კრისტალური იისფერით მარტივი შეღებვა ან ნიგროზინით ნეგატიური შეღებვა; გრამის რეაქციისთვის გამოიყენეთ გრამით შეღებვის სრული მეთოდი; ფიქსირებულ უჯრედებში ბირთვული DNA-სთვის განიხილეთ DAPI ფლუორესცენცია.

გამოიყენეთ ეს ცხრილი თითოეული მიმართულების შეზღუდვების შესადარებლად. ეს მეთოდის არჩევანია და არა არსებული პროტოკოლის ფარგლებში ერთი ბოთლის მეორით ჩანაცვლების ინსტრუქცია.

მარტივი ნაცხისთვის მეთოდი ფრთხილად ჩაანაცვლეთ

კრისტალური იისფერი პრაქტიკული კანდიდატია, როდესაც ამოცანა ბაქტერიული მორფოლოგიის ერთფეროვანი გამოსახულების მიღებაა. FDA-ს Bacteriological Analytical Manual-ში მოცემულია კრისტალური იისფერის ორი ფორმულაცია, რომლებიც მარტივი შეღებვისთვის არის შესაფერისი. გამოიყენეთ დოკუმენტირებული ფორმულაცია და მისი მომზადების მეთოდი; მხოლოდ საღებავის დასახელება სამუშაო რეაგენტს არ განსაზღვრავს.

კრისტალური იისფერი გრამით შეღებვაშიც გამოიყენება, მაგრამ ეს არ ნიშნავს, რომ კრისტალური იისფერით მარტივი შეღებვა გრამით შეღებვაა. ASM-ის გრამით შეღებვის პროტოკოლში დიფერენციალური შედეგი დამოკიდებულია კრისტალური იისფერის, იოდის, გაუფერულებისა და კონტრასტული შეღებვის თანმიმდევრულ მოქმედებაზე. ამ ეტაპების გამოტოვება ცვლის იმას, რის დადგენაც გამოსახულებით შეიძლება. ამ განსხვავებისთვის იხილეთ მარტივი შეღებვა გრამით შეღებვის წინააღმდეგ.

ნიგროზინი კონტურების გამოსავლენად სხვა მიდგომას გვთავაზობს: ის ფონს ამუქებს, ხოლო ბაქტერიული უჯრედები შედარებით ღია რჩება. Merck-ის ნიგროზინის ინსტრუქციებში არის მნიშვნელოვანი დეტალი, რომელიც შემცვლელების ზოგად სიაში შეიძლება გამოგრჩეთ. მითითებული სამუშაო ფორმულაცია ფორმალდეჰიდს შეიცავს. ამიტომ მხოლოდ სიტყვებიდან „ნეგატიური შეღებვა“ ვერ დაასკვნით, რომ მეთოდი ცოცხალ უჯრედებთან თავსებადია, მიუხედავად იმისა, რომ თავად უჯრედები შეუღებავად ჩანს. შეამოწმეთ სრული ფორმულაცია და ნიმუშის მომზადების მეთოდი.

ცოცხალი ნიმუშებისთვის განიხილეთ ოპტიკის შეცვლა

თუ გსურთ დააკვირდეთ უჯრედების მოძრაობას ან დაყოფას, კიდევ ერთი საღებავის დამატებამ შეიძლება დაკვირვება გაართულოს. როგორც Nikon განმარტავს გამჭვირვალე ნიმუშებში კონტრასტის შესახებ სახელმძღვანელოში, ფაზური კონტრასტი და დიფერენციალური ინტერფერენციული კონტრასტი, ანუ DIC, ნიმუშებს მათი ოპტიკური თვისებების განსხვავებების საშუალებით ხილულს ხდის. მათ შეუძლიათ ცოცხალი, შეუღებავი უჯრედების გამოვლენა, თუ მიკროსკოპს საჭირო კომპონენტები აქვს.

ეს არჩევანი ინარჩუნებს პრეპარატს შეუღებავად, მაგრამ ცვლის ხელმისაწვდომ ინფორმაციას. შეგიძლიათ დააკვირდეთ საზღვარს ან მოძრაობას ისე, რომ არ იცოდეთ, კონკრეტულად რომელმა მოლეკულამ შექმნა კონტრასტი. თუ კითხვა მოლეკულურ ლოკალიზაციას ეხება, ამის ნაცვლად შესაბამისი მარკირების მეთოდი აირჩიეთ.

ბირთვული DNA-სთვის Invitrogen-ის DAPI-სა და Hoechst-ის საღებავების შედარება განასხვავებს DAPI-ს გავრცელებულ გამოყენებას ფიქსირებულ უჯრედებში უფრო უჯრედგამტარი Hoechst 33342-ისგან, რომელიც ცოცხალი უჯრედების მარკირებისთვის უპირატესად გამოიყენება. ორივესთვის საჭიროა ფლუორესცენტული აღჭურვილობა. არცერთი მათგანი არ არის ფერადი ნათელი ველის საღებავის პირდაპირი შემცვლელი.

საღებავის ზემოქმედება და განათება ექსპერიმენტის პირობებად განიხილეთ. როდესაც თქვენი საზომი უჯრედების ქცევაა, შეადარეთ შეღებილი და შეუღებავი პრეპარატები.

წითელი უჯრედი ავტომატურად მკვდარ უჯრედს არ ნიშნავს

SYTO 9 და პროპიდიუმის იოდიდი ხშირად ერთად გამოიყენება ბაქტერიული მემბრანის მთლიანობის შესაფასებლად. BacLight-ის სახელმძღვანელო მთლიან მემბრანებს მწვანე შეღებვას, ხოლო დაზიანებულ მემბრანებს წითელ შეღებვას უკავშირებს. ასეთი ინტერპრეტაცია კონკრეტული ნიმუშისთვის ვალიდაციას საჭიროებს.

Rosenberg-ისა და მისი კოლეგების 2019 წლის კვლევა ამ პრობლემას კარგად აჩვენებს. ფოსფატურ-ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში მინაზე გაზრდილ 24-საათიან E. coli-ს ბიოფილმებში უჯრედების დაახლოებით 96% ადგილზე დაკვირვებისას პროპიდიუმის იოდიდზე დადებითი ჩანდა. თუმცა ავტორებმა შეაფასეს, რომ შეგროვების შემდეგ 82% კულტივირებადი იყო. კონფოკალურ გამოსახულებებზე წითლად შეღებილი მასალის ქვეშ მწვანე შიგთავსის მქონე უჯრედები ჩანდა, რაც შეცდომაში შემყვან სიგნალში უჯრედგარე ნუკლეინის მჟავების მონაწილეობაზე მიუთითებდა.

ეს პროცენტული მაჩვენებლები კვლევის პრეპარატებზე ჩატარებულ სხვადასხვა გაზომვას აღწერს და არა უნივერსალურ შესწორების კოეფიციენტს. პრაქტიკული დასკვნაა, რომ უნდა გადაამოწმოთ, რამ წარმოქმნა სიგნალი. ბიოფილმში ნუკლეინის მჟავის საღებავმა შეიძლება გამოავლინოს როგორც უჯრედების გარეთ არსებული მასალა, ისე დაზიანებული უჯრედების შიგთავსი. სიცოცხლისუნარიანობაზე დასკვნისთვის მკვლევრები რეკომენდაციას უწევენ დამატებით გაზომვებს, მაგალითად კულტივირებას ან მეტაბოლურ აქტივობას, ამასთან აღიარებენ, რომ თითოეულ მეთოდს თავისი შეზღუდვები აქვს.

შეამოწმეთ, სინამდვილეში რას შეიცავს ალტერნატივა

ალტერნატიული შეღებვის მეთოდი შეიძლება კვლავ შეიცავდეს მეთილენის ლურჯს. ამის მაგალითია Giemsa: Merck თავის პროდუქტს აღწერს, როგორც azure-eosin-methylene-blue ხსნარს, რომელიც სხვა გამოყენებებთან ერთად სისხლისა და ძვლის ტვინის ნაცხებისთვის არის განკუთვნილი. ეს შეიძლება იყოს სხვა მეთოდი სხვა ნიმუშისთვის, მაგრამ არ აკმაყოფილებს მეთილენის ლურჯის გამორიცხვის მოთხოვნას.

თუ კონკრეტული ნაერთის გამორიცხვა ექსპერიმენტის ნაწილია, გამოსახულებების შედარებამდე შეამოწმეთ რეაგენტის იდენტობა და ფორმულაცია. სახელწოდებებს შორის განსხვავებებს ეხება სახელმძღვანელო methyl blue, methylene blue და მსგავსი სახელწოდებების მქონე საღებავების შესახებ.

შედეგის გამოყენებამდე გადაამოწმეთ ჩანაცვლება

ახალი მეთოდისთვის გააკეთეთ მცირე შედარება წარმომადგენლობითი ნიმუშებისა და შესაბამისი კონტროლის გამოყენებით. შეძლებისდაგვარად მიკროსკოპის პარამეტრები შესადარისად შეინარჩუნეთ. ჩაიწერეთ რეაგენტის ფორმულაცია, ნიმუშის მომზადება, ექსპოზიცია და ვიზუალიზაციის პირობები, რათა უკეთესი გარეგნობის გამოსახულება მხოლოდ უპირატესად კი არ ჩაითვალოს, არამედ შესაძლებელი იყოს მისი მიზეზების გამოკვლევა.

წარმატება თავდაპირველ კითხვასთან მიმართებით შეაფასეთ. მორფოლოგიისთვის განსაზღვრეთ, კვლავ შესაძლებელია თუ არა უჯრედების საზღვრებისა და განლაგების ინტერპრეტაცია. ბირთვული მარკირებისთვის შეაფასეთ სიგნალის მდებარეობა და ფონი. სიცოცხლისუნარიანობისთვის მხოლოდ მიმზიდველი ფერადი განცალკევებით ნუ შემოიფარგლებით და დამატებითი მტკიცებულება მოითხოვეთ. უფრო ფართო სახელმძღვანელო მეთილენის ლურჯით შეღებვისა და ლაბორატორიული გამოყენებების შესახებ განმარტავს, როგორ უკავშირდება ერთმანეთს დაკვირვება და პრეპარატის მომზადება.

აირჩიეთ ალტერნატივა, რომელიც თქვენთვის საჭირო გაზომვას ინარჩუნებს. ფერი მიღებული გამოსახულების მხოლოდ ერთ-ერთი თვისებაა.