სტატია
მეთილენის ლურჯი და უჯრედული სენესცენცია: რას ზომავს ფიბრობლასტებზე ჩატარებული ექსპერიმენტები
გავრცელებული მცდარი ინტერპრეტაცია ასეთია: ნაშრომში ნათქვამია, რომ მეთილენის ლურჯმა კულტივირებულ ფიბრობლასტებს პოპულაციის 20-ზე მეტი დამატებითი გაორმაგების საშუალება მისცა, ამიტომ მკითხველი ასკვნის, რომ ის სენესცენტურ უჯრედებს აშორებს ან ადამიანის სიცოცხლეს მსგავსი მასშტაბით ახანგრძლივებს. ასეთი დასკვნა ბუნებრივად შეიძლება მოგვეჩვენოს. თუმცა ის ორ სხვადასხვა ასპექტში მცდარია.
ძირითადი პრობლემა კონცეპტუალურია და არა რიცხობრივი. პოპულაციის გაორმაგებები, სენესცენციის მარკერები და ტელომერების გაზომვები სხვადასხვა კითხვას პასუხობს. მეთილენის ლურჯის შესახებ ფიბრობლასტებზე ჩატარებული კვლევები უმჯობესია განვიხილოთ, როგორც ლაბორატორიულ ჭურჭელში ერთი ტიპის უჯრედების სენესცენციაში შესვლის გადავადების შესწავლა, რომელსაც მიტოქონდრიული გაზომვები ამყარებს. ეს განსხვავდება უკვე სენესცენტური უჯრედების შერჩევითი მოცილებისგან და, თავის მხრივ, ორგანიზმის დაბერებისგანაც. ამ განსხვავების უფრო ფართო კონტექსტი განხილულია მასალაში იმის შესახებ, თუ როგორ განსაზღვრავს მიტოქონდრიული ელექტრონების ტრანსპორტი უჯრედის ენერგეტიკას, და მეთილენის ლურჯის კვლევებში გამოთქმული დასკვნების ინტერპრეტაციის საკითხებში.
პოპულაციის გაორმაგებები ისტორიას ითვლის და არა ახალგაზრდობას
ძირითადი შედეგების უმეტესობა მიღებულია IMR90 უჯრედებზე — ადამიანის ნაყოფის ფილტვის ნორმალურ ფიბრობლასტთა შტამზე, რომელსაც შეზღუდული რეპლიკაციური შესაძლებლობა აქვს. IMR90 ფიბრობლასტებში მეთილენის ლურჯისა და რეპლიკაციური სიცოცხლის ხანგრძლივობის ადრეულ კვლევაში კულტურებს განსაზღვრული გრაფიკით პასირებდნენ და პოპულაციის გაორმაგებების კუმულაციურ რაოდენობას აღრიცხავდნენ, სანამ კულტურა გაყოფას შეწყვეტდა. ნანომოლარულ დონეებზე ზემოქმედებამ, ძირითადად 100 nM კონცენტრაციით, კულტურებს გაყოფის შეჩერებამდე 20-ზე მეტი დამატებითი გაორმაგების დაგროვების საშუალება მისცა.
პოპულაციის გაორმაგება აღრიცხვის ერთეულია. ის ასახავს, რამდენჯერ გაორმაგდა პოპულაცია დაახლოებით. ის პირდაპირ არ გვიჩვენებს, არის თუ არა ცალკეული უჯრედი სენესცენტური, მოსვენებულ მდგომარეობაში მყოფი, დიფერენცირებული ან მკვდარი. კულტურამ შეიძლება მეტი გაორმაგება დააგროვოს იმიტომ, რომ უჯრედები უფრო დიდხანს ინარჩუნებს გაყოფის უნარს, სტრესის პირობებში ნაკლები უჯრედი წყვეტს გაყოფას ნაადრევად, ან პირობები პროლიფერაციული ქვეპოპულაციის შერჩევას უწყობს ხელს. მხოლოდ რაოდენობრივი აღრიცხვით ამ გზების ერთმანეთისგან გამიჯვნა შეუძლებელია.
ამიტომ გაორმაგებების რაოდენობას მარკერებთან ერთად აფასებენ. რაოდენობა გვიჩვენებს, რამდენ ხანს გაგრძელდა პროლიფერაცია. მარკერები კი გვიჩვენებს, რა მდგომარეობაში გადავიდა გაყოფაშეჩერებული ან გადარჩენილი უჯრედები.
საბოლოო მაჩვენებლების გზამკვლევი: რას გვიჩვენებს თითოეული მარკერი
კულტურაში სენესცენცია რამდენიმე დამოუკიდებელი გაზომვით დახასიათებული ფენოტიპია. მას ვერც ერთი ცალკეული შეღებვა ან ცილა ვერ ადასტურებს.
ზრდის შეჩერება დნმ-ის სინთეზის დაკარგვით. მდგრად შეჩერებას ამოწმებენ BrdU-ს ან EdU-ს შემცირებული ინკორპორაციით, ბრტყელი მორფოლოგიითა და ხელახალი დათესვის შემდეგ ზრდის განუახლებლობით. ეს სენესცენტურ შეჩერებას დროებითი მოსვენებული მდგომარეობისგან განასხვავებს.
სენესცენციასთან ასოცირებული ბეტა-გალაქტოზიდაზა. SA-beta-gal-ის შეღებვა ლიზოსომურ აქტივობას დაახლოებით pH 6.0-ზე ავლენს. სენესცენტური ფიბრობლასტები ხშირად დადებითად იღებება ლიზოსომური მასის ზრდასთან ერთად. ეს სპეციფიკური მარკერი არ არის, ამიტომ მას პროლიფერაციისა და მოლეკულურ მარკერებთან ერთად აფასებენ.
p16-ისა და p21-ის გზები. p16 მოქმედებს CDK4-ის, CDK6-ისა და RB-ის გზის მეშვეობით. p21 ხშირად p53-ის მეშვეობით ინდუცირდება. მათი დონის ზრდა შეჩერებას ამყარებს, მაგრამ არც ერთი ცილა მხოლოდ სენესცენციისთვის დამახასიათებელი არ არის.
სეკრეტორული მდგომარეობა. სენესცენციასთან ასოცირებული სეკრეტორული ფენოტიპი, ანუ SASP, გულისხმობს ციტოკინების, ქემოკინების, ზრდის ფაქტორებისა და პროტეაზების შეცვლილ გამოყოფას. SASP-ის ფაქტორების რნმ-ის ან ცილების ანალიზები აღწერს, როგორ გადასცემს უჯრედები სიგნალებს მეზობელ უჯრედებს. ისინი რეპლიკაციურ შესაძლებლობას პირდაპირ არ ზომავს.
ოქსიდანტები და მიტოქონდრიული მაჩვენებლები. მეთილენის ლურჯის შესახებ ნაშრომები მიტოქონდრიულ კომპონენტსაც ამატებს: IV კომპლექსის რაოდენობასა და აქტივობას, ჟანგბადის მოხმარებას, ჰემის სინთეზს, მემბრანის მასას, მემბრანულ პოტენციალს, ATP-სა და ოქსიდანტების სიგნალებს. ისინი აღწერს მეტაბოლურ მდგომარეობას, რომელიც გაყოფის შეჩერების გადავადებას ახლავს. თავისთავად სენესცენციას არ განსაზღვრავს, მაგრამ შემოთავაზებულ მექანიზმს ამოწმებს. ჟანგვა-აღდგენითი ციკლის მოდელი, რომელშიც NAD(P)H მეთილენის ლურჯს აღადგენს, ხოლო ციტოქრომი c ხელახლა ჟანგავს, აღწერილია იმავე IMR90 კვლევაში, რომელიც ჟანგვა-აღდგენით ციკლს ოქსიდანტების შემცირებულ წარმოქმნას უკავშირებს. დოზირებისა და განაწილების შესაბამისი ლოგიკა განხილულია მეთილენის ლურჯის ფარმაკოლოგიისა და ქსოვილებზე ზემოქმედების მასალებში.
ტელომერების ეროზიის სიჩქარე. სწორი ერთეულია კვირების განმავლობაში თითო გაორმაგებაზე დაკარგული ფუძეთა წყვილები და არა სიგრძე დროის ერთ მომენტში. ნელი ეროზია ნიშნავს თითო რეპლიკაციაზე ნაკლებ შემოკლებას. ეს დაგრძელებას არ ნიშნავს, ხოლო სტრესმა შეიძლება IMR90 უჯრედების გაყოფა ტელომერების უმნიშვნელო ცვლილების პირობებშიც შეაჩეროს.
ფიბრობლასტების კვლევის სამი დიზაინის შედარება
ამ გვერდისთვის შექმნილი ორიგინალური მასალა ქვემოთ მოცემული შედარებაა. ის ერთ ხედში აერთიანებს უჯრედის ტიპს, ზემოქმედებას, გაზომვასა და შეზღუდვას.
| კვლევა | უჯრედები და ზემოქმედება | რა გაზომეს | რის ჩვენება არ შეუძლია |
|---|---|---|---|
| Atamna და სხვ., FASEB J 2008 | ნორმალური IMR90 ფიბრობლასტები, მეთილენის ლურჯით ქრონიკული ზემოქმედება ნანომოლარულ კონცენტრაციებში, 100 nM როგორც სტანდარტული პირობა | კუმულაციური გაორმაგებები, IV კომპლექსის შემცველობა, ჟანგბადის მოხმარების ზრდა 37-დან 70 პროცენტამდე, ჰემის სინთეზი, წყალბადის ზეჟანგით ან კადმიუმით გამოწვეული ნაადრევი სენესცენციისგან დაცვა, მე-2 ფაზის ფერმენტები HepG2 უჯრედებში | სენესცენტური უჯრედების მოცილება არ შემოწმებულა. ცხოველის ან ადამიანის სიცოცხლის ხანგრძლივობის საბოლოო მაჩვენებელი არ შეფასებულა. რეპლიკაციური სიცოცხლის ხანგრძლივობა აქ ლაბორატორიულ ჭურჭელში გაორმაგებებს ნიშნავს. |
| Atamna და სხვ., Redox Biology 2015, აღწერილი AMPK-ისა და IV კომპლექსის ბიოგენეზის შემდგომ მექანისტურ კვლევაში | IMR90 ფიბრობლასტები, ძირითადად 100 nM მეთილენის ლურჯი, შედარებისთვის AICAR როგორც AMPK-ის ქრონიკული აქტივატორი | NAD-ისა და NADH-ის თანაფარდობის დროში ცვლილება, AMPK-ის ხანმოკლე ფოსფორილირება, PGC-1alpha-სა და SURF1-ის ინდუქცია, IV კომპლექსის აქტივობის 100 პროცენტზე მეტი ზრდა, ოქსიდანტების 28 პროცენტით შემცირება, ტელომერების შენელებული ეროზია, დაახლოებით 18 დამატებითი გაორმაგება AICAR-ის შემთხვევაში დაახლოებით 2-თან შედარებით, უჯრედულ ციკლზე ეფექტის არარსებობა | AICAR-თან შედარებისას დოზები დაახლოებით 1000-ჯერ განსხვავდება და განსხვავებულია სპეციფიკურობაც, ამიტომ მოწმდება აქტივაციის ხასიათი და არა თანაბარ პირობებში მოქმედების ძალა. ტელომერების შედეგი ეხება კვირების განმავლობაში გაყოფად კულტურებს. |
| Xiong და სხვ., Aging Cell 2016, წარმოდგენილი პროგერიის ფიბრობლასტებში მიტოქონდრიული და ბირთვული დარღვევების აღდგენის კვლევაში | ჰატჩინსონ–გილფორდის პროგერიის კანის პირველადი ფიბრობლასტები და შესაბამისი ნორმალური საკონტროლო უჯრედები, უმეტესად 100 nM 5-დან 12 კვირამდე | მიტოქონდრიების ფორმა ფლუორესცენციული და ელექტრონული მიკროსკოპიით, მოძრაობა ცოცხალი უჯრედების ვიზუალიზაციით, სუპეროქსიდი, მემბრანული პოტენციალი, ATP, PGC-1alpha, პროლიფერაციისა და სენესცენციის მარკერები, აგრეთვე ბირთვის ბუშტუკოვანი გამობერილობები, პროგერინის ლოკალიზაცია, ჰეტეროქრომატინი და გენების ექსპრესია | კონკრეტული დაავადებისთვის დამახასიათებელი ნაადრევი დაბერების მოდელია და არა ნორმალური დაბერება. მორფოლოგიისა და მარკერების აღდგენა სენესცენტური უჯრედების მოცილებას არ ნიშნავს. ცხოველებში ეფექტიანობა ან კლინიკური საბოლოო მაჩვენებელი არ შეფასებულა. |
| Xue და სხვ., Cells 2021 მიმოხილვა, შეჯამებული მეთილენის ლურჯის, როგორც დაბერების საწინააღმდეგო კანდიდატი ნაერთის, მიმოხილვაში | ტვინის დაბერების, ნეიროდეგენერაციის, კანის, ჭრილობის შეხორცებისა და პროგერიის ლიტერატურის შეჯერება | მეთილენის ლურჯს განიხილავს, როგორც კატალიზურ ჟანგვა-აღდგენით ციკლში მონაწილე ნაერთს, რომელსაც შეუძლია I და III კომპლექსებში ელექტრონთა ნაკადის ნაწილების გვერდის ავლა, დაბერების თავისუფალრადიკალურ თეორიებთან მიმართებით | მხოლოდ ნარატიული შეჯერებაა. ის ჰიპოთეზებს აჯგუფებს და მიუთითებს, სად რჩება კლინიკური მტკიცებულებები არაერთმნიშვნელოვანი. |
მწკრივებში გამოკვეთილი საერთო სურათი ნებისმიერ ცალკეულ მწკრივზე უფრო მნიშვნელოვანია. მეთილენის ლურჯის დაბალი დოზა განმეორებით უკავშირდება უფრო ხანგრძლივ პროლიფერაციულ პერიოდს, IV კომპლექსის უფრო მაღალ აქტივობას, ოქსიდანტების დაბალ სიგნალებსა და გაუმჯობესებულ მორფოლოგიას. დიზაინი კვლავ ლონგიტუდურია: კვლევა იწყება გაყოფადი უჯრედებით, ზემოქმედება ხდება მათი გამრავლების პერიოდში და აღირიცხება, რამდენ ხანს გრძელდება გაყოფა. ასეთ სტრუქტურას გადავადების შესახებ დასკვნის გამყარება შეუძლია. სხვა დიზაინის გარეშე ის მოცილების შესახებ დასკვნას ვერ ამყარებს.
სენესცენციის გადავადება სენესცენტური უჯრედების მოცილება არ არის
გადავადება ნიშნავს, რომ გაყოფადი უჯრედები გაყოფის შეჩერებამდე უფრო დიდხანს აგრძელებს გაყოფას. მოცილება, რომელსაც ხშირად სენოლიზურ ეფექტს უწოდებენ, ნიშნავს უკვე სენესცენტური უჯრედების შერჩევით დახოცვას ან მათი რაოდენობის შემცირებას მაშინ, როცა მეზობელი პროლიფერაციული უჯრედები გადარჩება.
მეთილენის ლურჯის შესახებ ფიბრობლასტების ლიტერატურა პირველ სტრუქტურას ამოწმებს. დასაწყისში კულტურები პროლიფერაციულია, სერიული პასირებისას იღებს ნაერთს და გაყოფას მოგვიანებით წყვეტს. ამიტომ ისეთი მარკერები, როგორიცაა SA-beta-gal, p16, p21 და SASP-ის ფაქტორები, მოგვიანებით ჩნდება ან კონკრეტულ პასაჟზე უფრო დაბალ დონეზე ვლინდება. ასეთი სურათი მოსალოდნელია ყოველთვის, როცა დაწყების დრო გადაიწევს. ეს არ ამტკიცებს, რომ რომელიმე უკვე ჩამოყალიბებული სენესცენტური უჯრედი მოცილდა.
სენოლიზური ეფექტის დასადასტურებლად განსხვავებული სქემა იქნებოდა საჭირო: ჯერ კულტურა უნდა გადაიყვანონ დადასტურებულ სენესცენციაში, შემდეგ გამოიყენონ ნაერთი და შემდეგ აჩვენონ ამ სენესცენტური უჯრედების შერჩევითი დაკარგვა პროლიფერაციულ საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით, სიცოცხლისუნარიანობისა და სიკვდილის პირდაპირი გაზომვებით. მხოლოდ მარკერის შემცირება საკმარისი არ არის, რადგან ექსპრესია შეიძლება უჯრედების დაკარგვის გარეშეც შეიცვალოს, ხოლო დარჩენილმა პროლიფერაციულმა უჯრედებმა ჭურჭელში შეიძლება ჭარბად გამრავლდეს. ოთხი ციტირებული წყაროდან არც ერთი არ იყენებს მეთილენის ლურჯისთვის შერჩევითი შემცირების ამ დიზაინს, ამიტომ ზუსტი აღწერა კვლავ არის სენესცენციის გადამავადებელი ან სენესცენციის საწინააღმდეგო აქტივობა in vitro და არა სენოლიზური აქტივობა. ამ განსხვავების ოქსიდაციურ სტრესთან დაკავშირებული მხარე უფრო ვრცლად აიხსნება მასალაში იმის შესახებ, თუ როგორ აკონტროლებს უჯრედები ჟანგბადის რეაქტიულ ფორმებს.
ხანმოკლე სიგნალიზაციის შედეგი ამ განსხვავებას კიდევ უფრო მკაფიოს ხდის. IMR90-ის 2015 წლის კვლევაში მეთილენის ლურჯმა გამოიწვია NAD-ისა და NADH-ის თანაფარდობის ხანმოკლე ზრდა და AMPK-ის ხანმოკლე ფოსფორილირება, რასაც მოჰყვა PGC-1alpha-სა და SURF1-ის ინდუქცია; ორივე IV კომპლექსის ბიოგენეზს უკავშირდება. AICAR-ით AMPK-ის ქრონიკულმა აქტივაციამ დამატებითი გაორმაგებების მხრივ ბევრად უარესი შედეგი აჩვენა.
რეპლიკაციური სიცოცხლის ხანგრძლივობა ადამიანის დღეგრძელობა არ არის
უჯრედის რეპლიკაციური სიცოცხლის ხანგრძლივობა ითვლის გაორმაგებებს გაყოფის შეჩერებამდე კონტროლირებულ ლაბორატორიულ ჭურჭელში, ჟანგბადის, საკვები არისა და პასირების უცვლელი რეჟიმით. ადამიანის დღეგრძელობა აერთიანებს განვითარების, იმუნიტეტის, სისხლძარღვოვანი სისტემის, ღეროვანი უჯრედების ნიშების, ქცევისა და დაავადებების ათწლეულებს. ნაერთმა შეიძლება პირველი გაახანგრძლივოს ისე, რომ მეორე არ შეცვალოს, და უმეტეს შემთხვევაში ასეც ხდება.
პროგერიის ფიბრობლასტებს აქვს განსაზღვრული LMNA მუტაცია, რომელიც პროგერინს წარმოქმნის; მათ ახასიათებს ფრაგმენტირებული და ნაკლებად მოძრავი მიტოქონდრიები, დაბალი ATP, დეფორმირებული ბირთვები და ჰეტეროქრომატინის დაკარგვა. ნანომოლარულმა მეთილენის ლურჯმა გააუმჯობესა მიტოქონდრიული მაჩვენებლები და მნიშვნელოვნად აღადგინა ბირთვული მაჩვენებლები, მათ შორის ხელი შეუწყო პროგერინის მემბრანისგან გათავისუფლებას. ეს უჯრედულ დონეზე აღდგენის თვალსაჩინო შედეგია. თუმცა ის მაინც ფიბრობლასტებზე მიღებული შედეგია და ავტორებმა ცხოველებში გამოცდა სამომავლო სამუშაოდ განსაზღვრეს. თავად დაავადების მოდელი უფრო ვრცლად განიხილება მასალაში მეთილენის ლურჯის შესახებ პროგერიისა და ნაადრევი დაბერების მოდელებში.
აქედან გამომდინარეობს კითხვისას გასათვალისწინებელი პრაქტიკული საკონტროლო სია.
- გაარკვიეთ, ზემოქმედება გაყოფის შეჩერებამდე დაიწყო თუ უკვე ჩამოყალიბებული შეჩერების შემდეგ. მანამდე დაწყება გადავადებას ამყარებს. მოცილების დასადასტურებლად საჭიროა შემდგომი ზემოქმედება და შერჩევითი სიკვდილის მონაცემები.
- გაარკვიეთ, როგორი იყო საკონტროლო კულტურის გაორმაგებების მრუდი. კუმულაციური გაორმაგებების გარეშე მარკერების ცვლილებებს საყრდენი აკლია.
- მოითხოვეთ მარკერების სულ მცირე ორი კლასი, მაგალითად, პროლიფერაციის მარკირება p16-თან ან p21-თან და SA-beta-gal-თან ერთად, და არა მხოლოდ ერთი შეღებვა.
- გაარკვიეთ, როგორ იყო წარმოდგენილი ტელომერების მონაცემები. დროთა განმავლობაში თითო გაორმაგებაზე გამოთვლილ სიჩქარეს მნიშვნელობა აქვს. სიგრძის ერთჯერად გაზომვას — არა.
- გაარკვიეთ, რა ინარჩუნებდნენ უცვლელად. პასირებისას უჯრედების სიმკვრივე, ჟანგბადი, საკვები არის შეცვლა და მეთილენის ლურჯის ახალი თუ დაძველებული საწყისი ხსნარები — ყველა ეს ფაქტორი ფიბრობლასტების გაყოფის შეჩერებაზე მოქმედებს.
ამგვარად წაკითხული ფიბრობლასტების ლიტერატურა მეთილენის ლურჯს თანმიმდევრულ, მაგრამ შემოსაზღვრულ როლს ანიჭებს: დაბალი დოზით გამოყენებული, ჟანგვა-აღდგენითად აქტიური ნაერთი, რომელიც კულტივირებულ ადამიანის ფიბრობლასტებში რეპლიკაციურ სენესცენციას გადადებს და ამავდროულად მიტოქონდრიულ მაჩვენებლებს აუმჯობესებს. ყველაზე მყარი მექანისტური დეტალები ხანმოკლე ენერგეტიკულ სიგნალიზაციასა და IV კომპლექსის ბიოგენეზს უკავშირდება, ხოლო ამ ნაშრომებში არც სენესცენტური უჯრედების მოცილება და არც ადამიანის სიცოცხლის გახანგრძლივება არ არის ნაჩვენები.