შეუძლია მეთილენის ლურჯს მიტოქონდრიული III კომპლექსის გვერდის ავლა? რატომ განსხვავდება კვლევების შედეგები

ორმა ლაბორატორიამ შეისწავლა, შეუძლია თუ არა მეთილენის ლურჯს დაბლოკილი მიტოქონდრიული III კომპლექსის გვერდის ავლა. ერთის პასუხი უარყოფითი იყო, მეორისა — დადებითი. ორივეს ჰქონდა მონაცემები.

პირველმა კვლევამ, რომელიც თაგვის ტვინის მიტოქონდრიებზე ჩატარდა, აჩვენა, რომ საღებავს ეს არ შეუძლია. მეორე კვლევამ, მღრღნელების სამი სახეობის ტვინის მიტოქონდრიებზე, აჩვენა, რომ ნაწილობრივ შეუძლია. მესამე კვლევა, რომელიც თაგვის ღვიძლზე ჩატარდა, ხშირად ამავე კონტექსტშია ციტირებული, თუმცა სხვა საკითხს ამოწმებდა. თუ მას შესაბამის ადგილს მივუჩენთ, გაუგებრობის ნახევარი გაქრება.

აქ უნივერსალური მექანიზმის გამოცხადების საფუძველი არ არსებობს. გვაქვს სამი ექსპერიმენტი განსხვავებული ბლოკატორებით, დოზებითა და გასაზომი მაჩვენებლებით. ჯერ პირობებს გაეცანით. დასკვნები მათგან გამომდინარეობს.

რას ნიშნავს აქ გვერდის ავლა

ელექტრონები ჯაჭვში შედის I კომპლექსის გავლით (NADH-დან) ან II კომპლექსის გავლით (სუქცინატიდან), III კომპლექსის გავლით გადადის ციტოქრომ c-ზე, შემდეგ კი IV კომპლექსის გავლით — ჟანგბადზე. ამ გზაზე წარმოქმნილ გრადიენტს უჯრედი ATP-ის წარმოებისთვის იყენებს.

გვერდის ავლის შესახებ მტკიცების თანახმად, მეთილენის ლურჯი ელექტრონებს ბლოკირების ადგილამდე იღებს და მის შემდეგ გადასცემს. დაჟანგული საღებავი ელექტრონებს იღებს NADH-დან ან ჯაჭვის საწყისი კომპონენტებიდან და ლეიკომეთილენის ლურჯად გარდაიქმნება, ხოლო აღდგენილი ფორმა მათ ციტოქრომ c-ს გადასცემს ან ჯაჭვში აბრუნებს. თუ გადაცემა ბლოკირების ადგილის შემდეგ ხდება, სუნთქვა და მემბრანული პოტენციალი ნაწილობრივ აღდგება. თუ ის ბლოკირების ადგილას ან მანამდე ხდება, არაფერი აღდგება.

ამ დავაში ბევრს III კომპლექსის ერთი დეტალი განსაზღვრავს. კომპლექსში მიმდინარეობს Q ციკლი, რომელსაც ინჰიბიტორების შეკავშირების ორი უბანი აქვს. ანტიმიცინი Qi უბანს უკავშირდება. მიქსოთიაზოლი Qo უბანს უკავშირდება. კვლევა, რომელიც მხოლოდ ერთ-ერთს იყენებს, კომპლექსის მხოლოდ ნახევარს ამოწმებს.

პირველი კვლევა: თაგვის ტვინის მიტოქონდრიებში გვერდის ავლა არ დაფიქსირდა

Gureev-მა და კოლეგებმა გამოიყენეს C57BL/6 თაგვების ტვინის ქერქის მიტოქონდრიები, რომლებიც დიგიტონინით გამოყვეს და 0.1 mg per ml ცილის კონცენტრაციაზე შეამოწმეს. სუბსტრატები სამ რეჟიმს მოიცავდა: პირუვატი და მალატი, თითოეული 5 mM კონცენტრაციით; სუქცინატი 10 mM და გლუტამატი 2 mM კონცენტრაციით; და L-პროლინი 10 mM კონცენტრაციით. ბლოკატორები იყო როტენონი 1 micromolar კონცენტრაციით (I კომპლექსი) და ანტიმიცინი 1 microgram per ml კონცენტრაციით (III კომპლექსი). საღებავის დოზები იყო 0.5, 1 და 2 micromolar; ძირითად კონცენტრაციად გამოიყენებოდა 1 micromolar. მეთოდები და ჩანაწერები მოცემულია FEBS Letters-ის პუბლიკაციაში.

I კომპლექსის გვერდის ავლამ იმუშავა. როტენონმა ADP-ით სტიმულირებული სუნთქვა დაახლოებით 121-დან დაახლოებით 2 nmol per minute per mg-მდე შეამცირა, ხოლო 1 micromolar საღებავმა ის დაახლოებით 21-მდე აღადგინა. მემბრანული პოტენციალი აღდგა პირუვატისა და მალატის, ასევე L-პროლინის გამოყენებისას.

III კომპლექსის გვერდის ავლამ არ იმუშავა. ანტიმიცინმა სუნთქვა დაახლოებით 16-მდე შეამცირა, ხოლო საღებავმა ის მხოლოდ დაახლოებით 20-მდე გაზარდა. მემბრანული პოტენციალი არცერთ სუბსტრატზე არ აღდგა, საღებავის 5 micromolar-მდე დოზების შემთხვევაშიც კი. პეროქსიდის მონაცემებიც იმავე დასკვნაზე მიუთითებდა: მხოლოდ საღებავმა პეროქსიდის გამოყოფა დაახლოებით 76 pmol per minute per mg საწყისი სიჩქარიდან სამ დოზაზე, შესაბამისად, დაახლოებით 1170, 1460 და 1945-მდე გაზარდა, თუმცა ანტიმიცინმა საღებავით გამოწვეული ეს სიგნალი, შესაბამისად, დაახლოებით 25, 88 და 96 პროცენტით შეამცირა. აღდგენილი საღებავი პირდაპირ ჟანგბადთან რომ რეაგირებდეს, III კომპლექსის ბლოკირება სიგნალს არ უნდა თრგუნავდეს. ავტორებმა დაასკვნეს, რომ აღდგენილი საღებავი იჟანგება III კომპლექსის Qo უბანზე, ანტიმიცინის ბლოკირების ადგილამდე. მოკლე მარყუჟი სიტყვიერად ასე გამოიყურება: დონორებიდან საღებავზე, საღებავიდან Qo-ზე, შემდეგ კი ჩვეულებრივი გზით. როტენონის ბლოკირების გვერდის ავლა ხდება. ანტიმიცინისა — არა.

მეორე კვლევა: ნაწილობრივი გვერდის ავლა სამ სახეობაში, ინჰიბიტორების ორივე უბანზე

Svab-მა და კოლეგებმა ექსპერიმენტის სქემა გააფართოვეს. თაგვების, ვირთაგვებისა და ზღვის გოჭების ტვინის მიტოქონდრიები Percoll-ით გამოყვეს და იმავე 0.1 mg per ml კონცენტრაციაზე შეამოწმეს, პირუვატისა და მალატის ან გლუტამატისა და მალატის გამოყენებით, თითოეული 5 mM კონცენტრაციით. მათ III კომპლექსის ორი ბლოკატორი გამოიყენეს: ანტიმიცინი A 0.3 micromolar და მიქსოთიაზოლი 1 micromolar კონცენტრაციით. უმეტეს ანალიზში საღებავი 2 micromolar კონცენტრაციით გამოიყენებოდა, ციტოქრომ c-ზე ჩატარებულ სამუშაოში კი — 0.5. სამივე სახეობის კვლევა, ერთმანეთთან შესაბამისი პროტოკოლებით, მოცემულია ღია წვდომის სტატიაში.

სამივე სახეობაში ორივე ბლოკირების ნაწილობრივი გვერდის ავლა დაფიქსირდა. თაგვის მიტოქონდრიებში ანტიმიცინმა სუნთქვა დათრგუნა, საღებავმა კი ის დაახლოებით 60 პროცენტით გაზარდა — დაახლოებით 37-დან 59 nmol per minute per mg-მდე. მიქსოთიაზოლმა ის 88 პროცენტით, დაახლოებით 4.5-მდე შეამცირა, ხოლო საღებავმა ხუთჯერ, დაახლოებით 23-მდე გაზარდა. ორივე ინჰიბიტორის პირობებში მემბრანული პოტენციალი ნაწილობრივ რეპოლარიზდა; ოპტიკური არტეფაქტების გამოსარიცხად ის ორი საღებავით გაზომეს — საფრანინ O-თი და რატიომეტრული TMRM-ით.

ამ ნაშრომში უშუალოდ ელექტრონების გადაცემაც შეამოწმეს, რაც პირველ კვლევაში საერთოდ არ გაკეთებულა. ეგზოგენური აცეტილირებული ციტოქრომი c, 25 micromolar კონცენტრაციით, ენერგიზებული მიტოქონდრიების მიერ არ აღდგებოდა არც ინჰიბიტორების არსებობისას და არც მათ გარეშე, მაგრამ საღებავის დამატებამ ორივე შემთხვევაში აღდგენა გამოიწვია. უჯრედებისგან თავისუფალ ბუფერში NADH და საღებავი ციტოქრომ c-ს NADH-ის პროპორციული სიჩქარით აღადგენდა. უფრო გრძელი ნახტომი სიტყვიერად ასე გამოიყურება: აღმდგენი ეკვივალენტებიდან საღებავზე, საღებავიდან პირდაპირ ციტოქრომ c-ზე, IV კომპლექსიდან ჟანგბადზე. ეს გზა III კომპლექსს მთლიანად გამოტოვებს, ამიტომ ორივე ბლოკატორის გვერდის ავლა შესაძლებელია.

ამ განმარტებას კიდევ ორი გაზომილი მაჩვენებელი ამყარებს. მიქსოთიაზოლით დამუშავებულ მიტოქონდრიებში საღებავის დამატებისას NAD(P)H-ის ფლუორესცენცია შემცირდა, რაც ნიშნავს, რომ აღმდგენი ეკვივალენტები ახალი გზით იხარჯებოდა. ხოლო საღებავის შთანთქმის მაჩვენებელი 660 nm-ზე ყოველ მომდევნო დამატებას ასახავდა; ამავე დროს, ცენტრიფუგირების შემდეგ მიღებული სუპერნატანტები აჩვენებდა, რომ დაჟანგული საღებავის კონცენტრაცია ენერგიზებულ მიტოქონდრიებში ასზე მეტჯერ იზრდებოდა, შემდეგ კი პოტენციალის კოლაფსისას საღებავი მათ ტოვებდა. პროტონების ბალანსიც ამას შეესაბამება: პროტონების გადატუმბვის ეტაპების გამოტოვებისას ელექტრონების თითოეულ წყვილზე დაახლოებით 2 პროტონი რჩება 10-ის ნაცვლად. ამიტომ ჟანგბადის უფრო სწრაფი მოხმარება მხოლოდ ნაწილობრივი რეპოლარიზაციით რეალური გვერდის ავლის მოსალოდნელი სურათია და არა მის წინააღმდეგ მიმართული მტკიცებულება.

იმავე პრეპარატში დაფიქსირდა რეაქციები, რომელთა ზედაპირული წაკითხვაც შეცდომაში შეგვიყვანს. ინჰიბიტორისა და საღებავის ერთობლივი არსებობისას ADP სუნთქვას გაზრდის ნაცვლად ამცირებდა, ხოლო ტრანსპორტის ბლოკირება შენელების ნაცვლად ასტიმულირებდა მას; მემბრანული პოტენციალი კი კვლავ ჩვეულებრივი მიმართულებებით იცვლებოდა. ამ სისტემაში მხოლოდ ჟანგბადის მოხმარებაზე დაყრდნობა შეცდომაში შემყვანია.

მესამე კვლევა: ღვიძლის კვლევა, რომელმაც I და II კომპლექსები შეამოწმა და არა III

Lee-მ და Boelsterli-მ გამოიყენეს თაგვის ღვიძლის მიტოქონდრიები და კულტივირებული ჰეპატოციტები, რომლებიც დაზიანებული იყო ეფავირენზით (I კომპლექსი, IC50 დაახლოებით 30 micromolar) და ჰიდრაზინით, იზონიაზიდის მეტაბოლიტით (II კომპლექსი, IC50 დაახლოებით 30 micromolar). დაახლოებით 30 micromolar კონცენტრაციის საღებავმა აღადგინა NADH-ის დაჟანგვა, მემბრანული პოტენციალი და ATP, ამასთან შეამცირა ოქსიდანტები და ნეკროზული სიკვდილი. Redox Biology-ის ნაშრომში ეს მოდელირებულია როგორც საღებავით ელექტრონების გადატანა დაზიანებული I და II კომპლექსების გვერდის ავლით.

ეს შედეგი ჯაჭვის ადრეული მონაკვეთების შესახებ დადასტურებულ კონტექსტს წარმოადგენს და III კომპლექსზე არაფერს ამბობს, რადგან იქ არაფერი ყოფილა დაბლოკილი. ის ვერ ადასტურებს და ვერ უარყოფს ტვინზე ჩატარებული ვერცერთი კვლევის შედეგს.

პირობების მატრიცა

ოთხი მიზეზი, რატომ შეიძლება III კომპლექსის ორივე კვლევა მართებული იყოს საკუთარი პირობებისთვის

1. ბლოკატორით ჩარევა ერთნაირი არ იყო. მხოლოდ ანტიმიცინი 1 microgram per ml კონცენტრაციით, შედარებით ანტიმიცინთან 0.3 micromolar კონცენტრაციით და Qo უბნის ცალკე ბლოკატორთან. საღებავის გზა, რომელიც ელექტრონებს Qo უბანზე აწვდის, სწორედ იქ ვერ მუშაობს, სადაც პირდაპირ ციტოქრომ c-ზე გადაცემის გზა წარმატებულია. ერთი უბანი ორივეს ვერ წარმოადგენს.

2. საღებავის დოზა და დრო განსხვავდებოდა. ძირითადი კონცენტრაციები იყო 1 და 2 micromolar — რედოქს-ციკლში მონაწილე ნივთიერებისთვის, რომლის შეთვისებაც და ციტოქრომ c-ის უშუალო აღდგენაც კონცენტრაციასა და დროზეა დამოკიდებული. დოზის მცირე სხვაობამ და გაზომვის განსხვავებულმა დრომ შეიძლება ერთი ქსელის სხვადასხვა მონაკვეთი გამოავლინოს.

3. პრეპარატები განსხვავდებოდა. დიგიტონინით გამოყოფა და Percoll-ის გრადიენტით გამოყოფა ნაწილობრივ თანხვედრილ, თუმცა არა იდენტურ მიტოქონდრიულ პოპულაციებს არჩევს. ცილის კონცენტრაცია ორივეგან 0.1 mg per ml იყო, ამიტომ ეს ცვლადი გამოირიცხება, მაგრამ სუბპოპულაცია და მთლიანობა — არა. სახეობის განსხვავებაც გამოირიცხა შესაძლო მიზეზად: მეორე ჯგუფმა იგივე ფენოტიპი თაგვშიც გაიმეორა.

4. სუბსტრატული მდგომარეობა განსაზღვრავს, რა შეუძლია საღებავს. სუბსტრატების სამი რეჟიმი NADH-თან დაკავშირებული წყვილების წინააღმდეგ. NADH-ის მიწოდება და მემბრანული პოტენციალი ერთობლივად განსაზღვრავს, რამდენად სწრაფად აღდგება საღებავი და სად განაწილდება ის; გზა კი, რომელსაც დაჟანგული ციტოქრომ c-ის გვერდით აღდგენილი საღებავი სჭირდება, ამ არჩევანზეა დამოკიდებული.

როგორ წავიკითხოთ შემდეგი მტკიცება გვერდის ავლის შესახებ

იკითხეთ, რომელი კომპლექსი დაიბლოკა, რომელი ინჰიბიტორით, რომელ უბანზე და რა დოზით. იკითხეთ საღებავის კონცენტრაცია და გაზომვის დრო. იკითხეთ ქსოვილის, სახეობის, გამოყოფის მეთოდის, ცილის კონცენტრაციისა და სუბსტრატის შესახებ. ასევე იკითხეთ, თანხვედრილია თუ არა პოტენციალის, სუნთქვის, რედოქს-მდგომარეობისა და უშუალო გადაცემის ანალიზის შედეგები, რადგან აქ მხოლოდ ჟანგბადის მოხმარება არაერთხელ მიუთითებდა მცდარ მიმართულებაზე.

მოკლე, შეზღუდული შეჯამება ძალაში რჩება. საღებავით I კომპლექსის გვერდის ავლა შეთანხმებულად მიიჩნევა. III კომპლექსის შემთხვევაში, თაგვის მიტოქონდრიებში ანტიმიცინით 1 microgram per ml და საღებავით 1 micromolar კონცენტრაციაზე ფუნქციური გვერდის ავლა არ ჩანს; ხოლო სამ სახეობაში ანტიმიცინით 0.3 micromolar ან მიქსოთიაზოლით 1 micromolar და საღებავით 2 micromolar კონცენტრაციაზე ჩანს ნაწილობრივი გვერდის ავლა, საღებავიდან ციტოქრომ c-ზე უშუალო გადაცემით. ეს წინადადებები ერთმანეთს არ გამორიცხავს. ნებისმიერი უფრო ფართო დასკვნა ექსტრაპოლაციაა.

დაკავშირებული მასალები სადავო მტკიცებას უდავო ქიმიის ფარგლებში ტოვებს: როგორ გადააქვს მეთილენის ლურჯს ელექტრონები — გადაცემის მექანიზმისთვის, I კომპლექსის გვერდის ავლის ექსპერიმენტები — ჯაჭვის ადრეული მონაკვეთის დადასტურებული შემთხვევისთვის, მემბრანული პოტენციალის გაზომვები და მათი არტეფაქტები — იმის გასაგებად, თუ რატომ გახდა საჭირო ორი საღებავი, და რედოქს-ციკლში მონაწილე ნივთიერებებთან ლაბორატორიული მუშაობა — დოზირებისა და დროის შერჩევის შეცდომების გასათვალისწინებლად.