მეთილენის ლურჯი როგორც ანტიოქსიდანტი და პროოქსიდანტი: რა ცვლის შედეგს?

წარმოიდგინეთ, რომ ორი ლაბორატორია ერთსა და იმავე ლურჯ საღებავს ამოწმებს და საპირისპირო შედეგებს აქვეყნებს. პირველში ტვინიდან გამოყოფილი მიტოქონდრიები უკეთ სუნთქავს და მეტ ATP-ს წარმოქმნის. მეორეში იმავე ტიპის პრეპარატი გაცილებით მეტ წყალბადის ზეჟანგს გამოყოფს. ორივე ანგარიში სწორია. ისინი ერთი და იმავე ციკლის ორ მხარეს აღწერს, ხოლო დაბნეულობა მაშინ იწყება, როცა მკითხველი ერთ მხარეს სრულ სურათად აღიქვამს.

შეცდომაა კითხვა, თუ რომელი იარლიყი შეეფერება მოლეკულას. მეთილენის ლურჯი ელექტრონების გადამტანია, რასაც უფრო ფართო კონტექსტში მისი უჯრედული ბიოლოგიის სამიზნეების რუკა აჩვენებს. დაჟანგული საღებავი ელექტრონებს იღებს და უფერო leucoMB-დ იქცევა. leucoMB ამ ელექტრონებს შემდეგ მიმღებს გადასცემს და ისევ ლურჯდება. დაკვირვების შედეგი დამოკიდებულია იმაზე, ვინ გასცემს ელექტრონებს, ვინ იღებს მათ და შეუძლია თუ არა სისტემას გზად წარმოქმნილი წყალბადის ზეჟანგის მოცილება. არსებითი კითხვა არასოდეს არის, წარმოადგენს თუ არა საღებავი ანტიოქსიდანტს. კითხვა ისაა, რის საშუალებას აძლევს პირობები ამ გადამტანს.

ციკლი, რომელიც ორივე მხარეს წარმოშობს

სიბნელეში ძირითადი ციკლი მოკლეა. NADH, NADPH ან სასუნთქი ჯაჭვის გადამტანები საღებავს აღადგენს. შემდეგ აღდგენილ საღებავს რამდენიმე კონკურენტული გზა აქვს. მას შეუძლია ელექტრონები ციტოქრომ c-ს გადასცეს და დაზიანებული კომპლექსის შემოვლით ნაკადს შეუწყოს ხელი; სწორედ ამიტომ, I ან III კომპლექსის ბლოკირებისას სუნთქვა და მემბრანული პოტენციალი ნაწილობრივ აღდგება. ან შეუძლია ელექტრონები უშუალოდ ჟანგბადს გადასცეს, რაც ლურჯ ფორმას აღადგენს და წყალბადის ზეჟანგს წარმოქმნის. რადგან საღებავი ხელახლა აღდგება, მის მცირე რაოდენობას შეუძლია ეს ციკლი მრავალჯერ გაიმეოროს, თან მუდმივად მოიხმაროს აღმდგენი ეკვივალენტები და მუდმივად წარმოქმნას ზეჟანგი.

კიდევ ორი განშტოება ქიმიურ პროცესს მთლიანად ცვლის. თავისუფალი სპილენძი ან რკინა ფენტონის ტიპის რეაქციებით ამ დიფუზირებად ზეჟანგს გაცილებით დამაზიანებელ ადგილობრივ ოქსიდანტებად გარდაქმნის. წითელი სინათლე ცალკე ფოტოქიმიურ განშტოებას ააქტიურებს: აღგზნებული საღებავი ენერგიას ჟანგბადს გადასცემს და წარმოქმნის სინგლეტურ ჟანგბადს — ნაწილაკს, რომელიც დეტალურად არის განხილული I და II ტიპის ფოტოქიმიის განმარტებაში. სიბნელეში მიმდინარე ჟანგვა-აღდგენითი ციკლი, ლითონებით გაძლიერებული დაზიანება და ფოტოდინამიკური დაზიანება სამი განსხვავებული მექანიზმია, რომლებსაც უბრალოდ ერთი საწყისი მოლეკულა აერთიანებს.

პირობებისა და შედეგების მატრიცა

ქვემოთ მოცემული ცხრილი შესანახად ღირებული შეჯამებაა. თითოეულ მწკრივში მოცემულია ერთი ცვლადი, მის მიერ გამოწვეული ცვლილების მიმართულება და შესაბამისი ექსპერიმენტი. დადებითი ნიშნავს დამცავ ეფექტს ან გაუმჯობესებულ მაჩვენებელს. უარყოფითი ნიშნავს მეტ ოქსიდანტს, მეტ გამოფიტვას ან მეტ დაზიანებას.

მთავარი სწორედ მწკრივებს შორის გამოვლენილი კანონზომიერებაა. ზეჟანგის წარმოქმნა და ბიოლოგიური დაცვა ორი დამოუკიდებელი განზომილებაა. ერთსა და იმავე ზემოქმედებას პირველში უარყოფითი, მეორეში კი დადებითი შედეგი შეიძლება ერთდროულად ჰქონდეს.

რატომ იძლევა ერთი და იგივე დოზა განსხვავებულ პასუხებს

კონცენტრაცია გადამტანის გამტარუნარიანობას განსაზღვრავს და არა საბოლოო შედეგს. დაუზიანებელი ტვინის მიტოქონდრიების კვლევაში ტვინის მიტოქონდრიებიდან ზეჟანგის გამოყოფის შესამჩნევი ზრდა 50 nM-დან იწყებოდა, ხოლო სიბნელეში მიტოქონდრიული დნმ-ის აშკარა დაზიანებას 100 uM სჭირდებოდა. პირველ სიგნალსა და გენოტოქსიკურობას შორის ეს დაახლოებით ორი ათასჯერადი სხვაობაა, მაგრამ უსაფრთხოების მარაგს არ წარმოადგენს. საბოლოო მაჩვენებლები, კომპარტმენტები და ზემოქმედების ხანგრძლივობა განსხვავდება, ამიტომ ეს რიცხვები სხვადასხვა მოვლენას აღნიშნავს და არა ერთი მრუდის წერტილებს. დოზა–პასუხის განხილვა დაბალ კონცენტრაციაზე სიგნალსა და მაღალ კონცენტრაციაზე დაზიანებას შორის ასეთ სხვაობას ჰორმეზისის უფრო ფართო კონტექსტში ათავსებს.

სუბსტრატი განსაზღვრავს, საიდან შედის ელექტრონები. NADH-თან დაკავშირებული ენერგეტიკული სუბსტრატები საღებავს უხვ აღმდგენ ეკვივალენტებს აწვდის როგორც სასარგებლო შემოვლითი გზისთვის, ისე ჟანგბადთან არაპროდუქტიული რეაქციისთვის. ხშირად ციტირებული შეჯამება, თითქოს სუქცინატი საღებავს ანტიოქსიდანტად აქცევს, გლუტამატი კი — პროოქსიდანტად, მონაცემებს გადაჭარბებულად განმარტავს: გულის კვლევაში სუქცინატის პირობებში ზეჟანგის გაზომვისას როტენონიც გამოიყენებოდა, ხოლო ქსოვილი და დოზა განსხვავდებოდა ტვინის კვლევისგან, რომელმაც ყველა სუბსტრატისა და სუნთქვის მდგომარეობის პირობებში ზეჟანგის მატება აჩვენა.

სინათლე მექანიზმს ცვლის და არა მხოლოდ ეფექტის სიდიდეს. ამ ნაკრებში ყველაზე მკაფიო კონტრასტია 20 uM სიბნელეში, რომელსაც მიტოქონდრიული დნმ-ის ფრაგმენტებზე შესამჩნევი ეფექტი არ ჰქონდა, და 20 uM წითელი სინათლის ქვეშ, რომელიც ყველა მათგანს აზიანებდა. ვინც განათებულ ექსპერიმენტს სიბნელეში ჩატარებულს ადარებს, სინამდვილეში ფოტოქიმიას ჟანგვა-აღდგენით ციკლს ადარებს.

ლითონები ოქსიდანტს გარდაქმნის. ლითონების გარეშე საღებავის სიბნელეში მიმდინარე ციკლი ზეჟანგს წარმოქმნის — დიფუზირებად მოლეკულას, რომელსაც უჯრედები სასიგნალოდაც იყენებს. ხელმისაწვდომი სპილენძის ან რკინის არსებობისას, NADH-ით აღდგენილი საღებავი ლითონის აღდგენას უწყობს ხელს, ხოლო აღდგენილი ლითონი ზეჟანგს დნმ-ის სიახლოვეს ჰიდროქსილის ტიპის ან სპილენძის პეროქსიდულ ნაწილაკებად ააქტიურებს. ასე წარმოქმნა NADH-ისა და ლითონის იონების გამოყენებით უჯრედებისგან თავისუფალ სისტემაში ჩატარებულმა კვლევამ ერთი და იმავე საწყისი საღებავიდან როგორც ცხელი წერტილების შერჩევითი, ისე დნმ-ის ფართო დაზიანება. ამ განშტოების მნიშვნელობას კომპარტმენტში ლითონების რეგულაცია განსაზღვრავს და არა მხოლოდ საღებავი.

ენერგეტიკული უზრუნველყოფა განსაზღვრავს, შეუძლია თუ არა უჯრედს დანახარჯის ანაზღაურება. 2–20 uM საღებავით ზემოქმედების ქვეშ მყოფ ენდოთელურ უჯრედებში გლუკოზის მოცილებამ ოქსიდანტური დანახარჯი გამოავლინა, ხოლო გლუკოზის მიწოდებამ ის გააქრო, მიუხედავად იმისა, რომ გლუკოზა საღებავის აღდგენასაც აჩქარებდა. რესურსებით უზრუნველყოფილი დაცვით უფრო სწრაფი ციკლი სჯობს ნელ ციკლს გამოფიტული დამცავი სისტემებით. ნებისმიერი მტკიცება ოქსიდანტური ეფექტის შესახებ, რომელიც გლუკოზის ან NADPH-ის მდგომარეობას გამოტოვებს, არასრულად მიიჩნიეთ.

ქსოვილი განსაზღვრავს, რა მექანიზმებია ხელმისაწვდომი. ენდოთელური უჯრედები გლუკოზის მეტაბოლიზმით NADPH-ს აღადგენს და ციტოზოლურ ანტიოქსიდანტურ მარაგებს შეიცავს. გამოყოფილ მიტოქონდრიებს ეს არცერთი არ გააჩნია. გასუფთავებულ დნმ-ს აღდგენის მექანიზმიც კი არ აქვს. ერთი პრეპარატის შედეგი დანარჩენებზე ცოტას გვეუბნება; სწორედ ამიტომ, ქსოვილისთვის სპეციფიკური პასუხების შესახებ დაგეგმილ სტატიაში ეს სისტემები ერთმანეთისგან უნდა გაიმიჯნოს.

პირდაპირი გაზომვა შემდგომი თავდაცვა არ არის

ბევრი ტექსტი აერთიანებს ორ დონეს, რომლებსაც ექსპერიმენტები ერთმანეთისგან განასხვავებს. ერთი დონე კითხულობს, რამდენი ოქსიდანტი წარმოიქმნა. მეორე — როგორ უპასუხა უჯრედმა.

Amplex-ის ტიპის ზეჟანგის ანალიზები პირველ დონესთან ყველაზე ახლოს დგას, თუმცა ისინიც კი ჯამურ ნაკადს აჩვენებს, ანუ წარმოქმნას მინუს დაშლა და მინუს გამოტანა. ტვინის მიტოქონდრიების კვლევაში ორივე მხარე იცვლებოდა: მეტი ზეჟანგი წარმოიქმნებოდა და დამატებული ზეჟანგის ერთჯერადი ულუფა უფრო ნელა იშლებოდა. შემდგომ საფეხურებზეა გლუტათიონის დაჟანგვა, ასკორბატის მოხმარება, დაჟანგული გუანინი და დნმ-ის დაზიანებები, რომლებიც პოლიმერაზას ბლოკავს. ყოველი ნაბიჯი ოქსიდანტსა და გაზომილ მაჩვენებელს შორის დამატებით ბიოლოგიურ პროცესებს ათავსებს.

Nrf2-ით მართული ანტიოქსიდანტური ფერმენტები და მიტოქონდრიული ბიოგენეზი მეორე დონეს მიეკუთვნება. ეს ადაპტაციური პროგრამებია, რომელთა გააქტიურება ზეჟანგის მცირე, ხანმოკლე მატებას შეუძლია. ტვინის მიტოქონდრიების დაცვის კვლევის ავტორები სწორედ ასეთ მსუბუქ სტრესს ვარაუდობენ გამომწვევ ფაქტორად, თუმცა აღნიშნავენ, რომ Nrf2-ის გავლით მიზეზშედეგობრივი ჯაჭვი წინა ნაშრომებს ეყრდნობა და არა მათ მიერ სრულად ჩატარებულ დემონსტრირებას. დაცვა, რომელიც საათების შემდეგ ახალი ცილების მეშვეობით ჩნდება, არ ნიშნავს, რომ საწყისი ქიმიური პროცესი ანტიოქსიდანტური იყო. ეს ნიშნავს, რომ მცირე პროოქსიდანტურმა მოვლენამ უფრო ძლიერი თავდაცვა უზრუნველყო. ასეთი მტკიცებების შეფასების წესები, მათ შორის ანალიზების შეზღუდვები და პრეპარატებს შორის განსხვავებები, განხილულია მეთილენის ლურჯის კვლევების წაკითხვის გზამკვლევში.

რატომ არ ემთხვევა ანალიზების შედეგები ერთმანეთს

ზოგადი ზონდი, მაგალითად დიჰიდროფლუორესცეინი, ზონდის ფართო სპექტრის დაჟანგვას ასახავს და არა ზეჟანგის კონცენტრაციას. ის პეროქსიდაზისა და ჰემის ქიმიაზეა დამოკიდებული და შეიძლება ვერ დააფიქსიროს ზეჟანგის მატება, რომელსაც დაკალიბრებული Amplex-ის ანალიზი აღრიცხავს. ტვინის მიტოქონდრიების კვლევამ ზეჟანგის მკვეთრი მატება აჩვენა სუპეროქსიდის შესაბამისი სიგნალის გარეშე; ეს გვაფრთხილებს, რომ ანტიოქსიდანტური ეფექტის შესახებ რომელიმე ერთ საღებავზე დაფუძნებული მტკიცება უპირობოდ არ უნდა მოვიხმოთ. ოპტიკური გადაფარვა საფუძვლიანი საკონტროლო საკითხია, რადგან საღებავი ხილულ სინათლეს შთანთქავს გავრცელებული აღგზნებისა და გამოსხივების დიაპაზონების სიახლოვეს. თუმცა გულდასმით ჩატარებულ კვლევაში სისტემა ზეჟანგის ცნობილი რაოდენობებით დააკალიბრეს, აღგზნების სინათლით ზემოქმედება შეამცირეს ისე, რომ სიგნალი მცირედ შეიცვალა, და ცალკე ელექტროდით დაადასტურეს ზეჟანგის უფრო ნელი მოცილება. ინტერფერენცია შესამოწმებელი საკონტროლო ფაქტორია და არა შედეგის ავტომატურად უარყოფის საფუძველი.

კალციუმის შედეგიც სიზუსტის იმავე საჭიროებას აჩვენებს. გულის კვლევაში საღებავის ხანმოკლე ზემოქმედებას გამტარობის გარდაქმნამდე კალციუმის საერთო დატვირთვა არ შეუცვლია, თუმცა ბლოკირებულ ტვინის მიტოქონდრიებში კალციუმის შთანთქმის სიჩქარე გააუმჯობესა დიაბეტზე ფოკუსირებულ გულის მიტოქონდრიების კვლევაში. განსხვავებული მაჩვენებლები, განსხვავებული სისტემები — წინააღმდეგობა არ არის.

შესამოწმებელი სია დასკვნის ნდობამდე

ყოველი დასკვნა ანტიოქსიდანტური ან პროოქსიდანტური მოქმედების შესახებ კონკრეტული სისტემის ანგარიშად აღიქვით და ხუთი კითხვა დასვით. რა კონცენტრაციაზე და რომელ კომპარტმენტში? რომელი ელექტრონის დონორით და რომელი კონკურენტი მიმღებით? სინათლეში თუ სიბნელეში, რა ტალღის სიგრძითა და დოზით? რომელი ლითონებია ხელმისაწვდომი და რამდენად უზრუნველყოფილია ენერგეტიკული სუბსტრატებისა და ანტიოქსიდანტების მარაგები? და რომელი ანალიზით — ოქსიდანტის ნაკადის, დაზიანების თუ ადაპტაციური პასუხის გაზომვით? ნებისმიერი ერთი პასუხის შეცვლამ შეიძლება ერთი და იგივე მოლეკულა მატრიცაში დამცავი შედეგიდან დამაზიანებელზე გადაიყვანოს, ყოველგვარი პარადოქსის გარეშე.