სტატია
მეთილენის ლურჯი და ფეროპტოზი: რკინა, ლიპიდების პეროქსიდაცია და უჯრედის სიკვდილი
ფეროპტოზი მემბრანის დაზიანებით გამოწვეული უჯრედის სიკვდილია. მემბრანებში არსებული პოლიუჯერი ცხიმები ჯაჭვური რეაქციით იჟანგება, მემბრანა ფუნქციას კარგავს და უჯრედი კვდება. ამ ქიმიურ პროცესს რკინა სჭირდება. მთელი კონცეფცია ამ წინადადებაშია თავმოყრილი, ხოლო ამ სტატიაში აღწერილი ყველაფერი მისი რომელიმე ნაწილის შემოწმებას ემსახურება.
აქ კითხვა უფრო ვიწროა: რას აკეთებს მეთილენის ლურჯი ამ ჯაჭვში უჯრედულ ექსპერიმენტებში და რას აჩვენებს სინამდვილეში მიღებული შედეგი. მოკლე პასუხი ასეთია: ორ ლაბორატორიულ კვლევაში ნანომოლარული კონცენტრაციის მეთილენის ლურჯმა შეამცირა მიტოქონდრიული ლიპიდების პეროქსიდაცია და უჯრედები ცოცხალი შეინარჩუნა იმ გამომწვევების ზემოქმედების შემდეგ, რომლებიც სხვა შემთხვევაში ფეროპტოზს იწვევს. უფრო ვრცელი პასუხი უფრო მნიშვნელოვანია, რადგან ჯაჭვის თითოეული რგოლი სხვადასხვა ჩარევით შემოწმდა და თითოეულ ჩარევას თავისი შეზღუდვები აქვს.
ფეროპტოზი ერთ აბზაცში
მემბრანის ფოსფოლიპიდს, რომელსაც პოლიუჯერი ცხიმოვანი მჟავის კუდი აქვს, სუსტი ადგილი გააჩნია: წყალბადის ატომები, რომელთა წართმევაც ადვილია. როგორც კი რადიკალი ერთ-ერთ მათგანს წაართმევს, ლიპიდს ჟანგბადი უერთდება, წარმოიქმნება ლიპიდური პეროქსილური რადიკალი და ეს რადიკალი წყალბადს შემდეგ ლიპიდს ართმევს. რეაქცია მემბრანის გასწვრივ ვრცელდება, თუ რამე არ შეაჩერებს.
მთავარი შემაჩერებელი მექანიზმია ფერმენტი GPX4, რომელიც გლუტათიონის გამოყენებით ლიპიდურ პეროქსიდებს უვნებელ ლიპიდურ სპირტებად აღადგენს. ლაბორატორიული გამომწვევები ამ დაცვას განსაზღვრულ წერტილებში უტევს. ერასტინი სისტემა xc-minus-ის მეშვეობით ცისტინის შემოტანას ბლოკავს, რის შედეგადაც უჯრედს გლუტათიონის სინთეზისთვის საჭირო ცისტეინი აკლდება. ბუთიონინის სულფოქსიმინი უშუალოდ გლუტათიონის სინთეზს ბლოკავს. RSL3 თავად GPX4-ს აინჰიბირებს. სამივე შემთხვევაში პეროქსიდები გაუვნებელყოფელი რჩება, თუმცა ეს სხვადასხვა ეტაპზე ხდება, ამიტომ ერთი გამომწვევით მიღებული შედეგი ავტომატურად დანარჩენებზეც არ ვრცელდება.
ფეროპტოზი აპოპტოზისგან მისი განმსაზღვრელი თვისებებით განსხვავდება. მას არც კასპაზების კასკადი ახლავს და არც აპოპტოზური სხეულაკები. რკინის ქელატორები, მაგალითად დეფეროქსამინი, და რადიკალების დამჭერი აგენტები, მაგალითად ფეროსტატინ-1, მას თრგუნავს. მკვლევრები სწორედ ამ პრაქტიკულ ტესტს იყენებენ იმის დასადგენად, რომ სიკვდილი ფეროპტოზულია და არა უბრალოდ ნეკროზული. უჯრედის რეგულირებული სიკვდილის გზების ფართო სურათი ამ განსხვავებას კონტექსტში ათავსებს, ხოლო ის, თუ როგორ არეგულირებენ უჯრედები ლაბილურ რკინას, ხსნის, რატომ არის ქელაცია ასეთი გადამწყვეტი საკონტროლო პირობა.
რა როლი აქვს მიტოქონდრიებს და რატომ იყო ეს სადავო
ადრეულ კვლევებში აღწერილი იყო, რომ მიტოქონდრიული დნმ-ის არმქონე უჯრედებშიც ხდება ფეროპტოზი, რაც მიანიშნებდა, რომ მიტოქონდრიები აუცილებელი არ არის. მოგვიანებით ჩატარებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ მიტოქონდრიების რაოდენობის შემცირებამ ან სუნთქვის ბლოკირებამ შეიძლება დათრგუნოს ცისტეინის დეფიციტით გამოწვეული ფეროპტოზი, მაგრამ არა GPX4-ის პირდაპირი ინჰიბირებით გამოწვეული ფეროპტოზი. ორივე შედეგი შეიძლება სწორი იყოს, თუ მიტოქონდრიების წვლილი დამოკიდებულია გამომწვევზე, უჯრედის ტიპსა და იმაზე, სად ხდება გადამწყვეტი პეროქსიდაცია.
კვლევა, რომელსაც ეს სტატია ეყრდნობა, ამ სადავო საკითხს კონკრეტული უჯრედული კომპარტმენტისადმი სპეციფიკური ზონდით მიუდგა. MitoCLox ლიპიდების პეროქსიდაციის ინდიკატორის მიტოქონდრიებზე დამიზნებული ვერსიაა: მიტოქონდრიების შიგნით ლიპიდურ პეროქსილურ რადიკალებთან შეხვედრისას მისი ფლუორესცენცია იცვლება. ერასტინით დამუშავებულ ფიბრობლასტებში მიტოქონდრიული ზონდის დაჟანგვა ჯერ კიდევ ცოცხალ უჯრედებში, სიკვდილამდე გამოვლინდა და უჯრედულ პოპულაციაში არაერთგვაროვანი იყო. ამ დროით თანმიმდევრობას მნიშვნელობა აქვს. სიკვდილის წინ გამოვლენილი პეროქსიდაცია შესაძლო მიზეზია. მხოლოდ მკვდარ უჯრედებში გაზომილი პეროქსიდაცია კი დაშლის ნარჩენებს ასახავს. თანმხლები გზამკვლევი ლიპიდების პეროქსიდაციის ანალიზებისა და იმის შესახებ, რას ასახავს თითოეული ზონდი განმარტავს, რატომ განსაზღვრავს ზონდის მდებარეობა სიგნალის მნიშვნელობას.
იგივე სურათი მეორე მოდელშიც გამოვლინდა. ლებერის მემკვიდრეობითი ოპტიკური ნეიროპათიის მქონე პაციენტის ფიბრობლასტები, რომლებსაც I კომპლექსის მუტაცია და საწყისად უფრო მაღალი ოქსიდაციური სტრესი ახასიათებს, გლუტათიონის გამოფიტვისას ფეროპტოზით იღუპებოდა, საკონტროლო ფიბრობლასტები კი ამას უძლებდა. მიტოქონდრიული ზონდის დაჟანგვა ამ შემთხვევაშიც პირველად ხდებოდა. დეტალები მოცემულია ფიბრობლასტების კვლევაში ფეროპტოზის დროს მიტოქონდრიული ლიპიდების პეროქსიდაციის შესახებ.
რა შეცვალა მეთილენის ლურჯმა ამ ექსპერიმენტებში
მეთილენის ლურჯი ჟანგვა-აღდგენითი გადამტანია. მისი დაჟანგული ფორმა I კომპლექსთან NADH-თან დაკავშირებული ქიმიური პროცესებიდან ელექტრონებს იღებს, ხოლო აღდგენილი ფორმა მათ ციტოქრომ c-ს გადასცემს, რომელიც ელექტრონებით IV კომპლექსს ამარაგებს. ამით ნაწილობრივ გვერდს უვლის ჯაჭვის იმ მონაკვეთს, სადაც ელექტრონები ჩვეულებრივ ჟანგბადზე გადადის და სუპეროქსიდს წარმოქმნის. მკითხველებმა, რომლებსაც გადაცემის სრული სურათი აინტერესებთ, უნდა დაიწყონ სტატიით როგორ გადააქვს მეთილენის ლურჯს ელექტრონები მიტოქონდრიებში.
ერასტინით დამუშავებულ ფილტვის ფიბრობლასტებში 250 ნანომოლარული კონცენტრაციის მეთილენის ლურჯმა, მიტოქონდრიებზე დამიზნებულ ანტიოქსიდანტებთან SkQ1-სა და MitoTEMPO-სთან ერთად, უჯრედების გადარჩენის ტესტში სიცოცხლისუნარიანობა შეინარჩუნა. დასკვნის ფარგლებს საკონტროლო პირობები განსაზღვრავს. ფეროსტატინ-1, ალფა-ტოკოფეროლი და დეფეროქსამინიც იცავდა უჯრედებს, რაც ადასტურებს, რომ სიკვდილი ფეროპტოზული იყო. ანტიოქსიდანტური ჯგუფის არმქონე SkQ1-ის ანალოგი არ იცავდა, რაც ჟანგვა-აღდგენით ქიმიაზე მიუთითებს და არა არასპეციფიკურ დაგროვებაზე. SkQ1-ის დაახლოებით 200 ნანომოლარზე მაღალი კონცენტრაციისას დაცვა სუსტდებოდა, რაც უფრო მაღალი დატვირთვისას ქინონური ანტიოქსიდანტების ცნობილ პროოქსიდანტურ ქცევას შეესაბამება. მეთილენის ლურჯსაც დოზაზე დამოკიდებული ორმაგი ქცევა აქვს: ამ კულტურებში დაბალ ნანომოლარულ დონეებზე იგი დამცავია, ხოლო უფრო მაღალ კონცენტრაციებზე ან ძლიერი განათებისას ჟანგვა-აღდგენითი ციკლირებით წყალბადის პეროქსიდის წარმოქმნა შეუძლია. დოზის ამგვარი კონტექსტი განხილულია სტატიაში ჟანგბადის რეაქტიული ფორმები მიტოქონდრიებში.
შემდეგ იზოლირებულ მიტოქონდრიებზე ჩატარებულმა ექსპერიმენტებმა ROS-ის წყაროები ერთმანეთისგან გამიჯნა. ორვალენტიანი რკინის თანდასწრებით, I კომპლექსის მომმარაგებელმა სუბსტრატებმა როტენონთან ერთად ზონდის დაჟანგვა გააძლიერა. როტენონი ჯაჭვს ფლავინის უბნის შემდეგ ბლოკავს, ამიტომ მის წინ მდებარე გადამტანები აღდგენილ მდგომარეობაში რჩება და მატრიქსისკენ მიმართული ფლავინიდან ელექტრონები ჟანგბადზე გადადის. III კომპლექსის მომმარაგებელი სუბსტრატები ანტიმიცინ A-სთან ერთად უხვად წარმოქმნიდა წყალბადის პეროქსიდს, მაგრამ ლიპიდების პეროქსიდაციას არ იწვევდა. საერთო ROS-სიგნალი იგივე იყო, მდებარეობა — განსხვავებული, შედეგიც — განსხვავებული. SkQ1 და მეთილენის ლურჯი, თითოეული ცალ-ცალკე, თრგუნავდა I კომპლექსით გამოწვეულ პეროქსიდაციას ისე, რომ თავად წყალბადის პეროქსიდის წარმოქმნას არ თრგუნავდა. ეს მათ მოქმედებას ROS-ის წარმოქმნის შემდეგ, ლიპიდების პეროქსიდაციის ეტაპზე ათავსებს.
რკინით გადატვირთვის მიმართულება და ლიპოფუსცინის მინიშნება
მეორე კვლევამ საკითხი რკინის მხრიდან შეისწავლა. სამვალენტიანი რკინის ამონიუმის ციტრატის სუბმილიმოლარული კონცენტრაციის ზემოქმედებისას H9c2 კარდიომიოციტებში წარმოიქმნა მიტოქონდრიული ROS, განვითარდა მიტოქონდრიული ლიპიდების პეროქსიდაცია, შემდეგ ფეროპტოზი, რასაც 24 საათის განმავლობაში ლიპოფუსცინის მსგავსი პიგმენტის დაგროვება მოჰყვა. ლიპოფუსცინი დაჟანგული ლიპიდებისა და ცილების ავტოფლუორესცენტული, რკინის შემცველი ნარჩენია, რომელიც ასაკთან ერთად გროვდება. აქ მისი სწრაფი გამოჩენა რკინით გამოწვეულ მწვავე პეროქსიდაციას დაბერების კლასიკურ მარკერთან აკავშირებს. ნანომოლარული კონცენტრაციის მეთილენის ლურჯმა და SkQ1-მა, თითოეულმა ცალ-ცალკე, თავიდან აიცილა პეროქსიდაცია, სიკვდილი და პიგმენტის დაგროვება. გულის იზოლირებულმა მიტოქონდრიებმა იგივე სურათი დაადასტურა: როტენონი ორვალენტიან რკინასთან ერთად იწვევდა პეროქსიდაციასა და პიგმენტის მსგავს სიგნალს, ხოლო ორივე აგენტი ამას ბლოკავდა. სრული თანმიმდევრობა აღწერილია H9c2 კარდიომიოციტებში რკინით გადატვირთვის კვლევაში. ამ ამბის პიგმენტთან დაკავშირებული მხარე განეკუთვნება თემას ლიპოფუსცინი და უჯრედული დაბერების მარკერები.
რას არ აჩვენებს უჯრედების გადარჩენის ტესტები
სიცოცხლისუნარიანობის ისეთი ტესტის მაჩვენებელი, როგორიცაა CellTiterBlue, გვიჩვენებს, კულტურის ჭურჭელში რამდენი უჯრედი რჩება მეტაბოლურად აქტიური გამომწვევისა და შესაძლო დამცავი აგენტის ერთობლივი ზემოქმედების შემდეგ. ეს განსაზღვრულ სისტემაში მექანიზმის შემოწმებაა. ეს მკურნალობის შედეგი არ არის. არცერთ ამ ექსპერიმენტში პაციენტისთვის დოზა არ მიუციათ, დაავადების საბოლოო მაჩვენებელი არ გაუზომავთ და ორგანიზმში თერაპიული ფანჯარა არ დაუდგენიათ.
ოთხი შეზღუდვა მკაფიოდ უნდა აღინიშნოს. პირველი: უჯრედების ტიპების სპექტრი ვიწროა — ფილტვის ტრანსფორმირებული ფიბრობლასტები, კანის პირველადი ფიბრობლასტები, მათ შორის მიტოქონდრიული დაავადების მქონე ერთი ხაზი, ვირთაგვის კარდიომიოციტების ხაზი და ვირთაგვის გულის იზოლირებული მიტოქონდრიები. მგრძნობელობა ხაზების მიხედვით განსხვავდებოდა, ხოლო LHON-ის ხაზი კვლევის ჩანაფიქრით უჩვეულოდ მოწყვლადი იყო. მეორე: გამომწვევები ლაბორატორიული უკიდურესობებია — ტრანსპორტის ან სინთეზის სრული ბლოკადა და რკინის ისეთი დატვირთვები, რომლებსაც არცერთი ქსოვილი მწვავედ არ შეხვდებოდა. მესამე: კონცენტრაცია გამრავლებით არ გადაითვლება. კულტურის საკვებ არეში ნანომოლარული კონცენტრაცია ადამიანის დოზა არ არის; ჭურჭელსა და ადამიანს შორის გასათვალისწინებელია მეთილენის ლურჯის განაწილება, სისხლსა და ქსოვილებში მისი უფერო ფორმამდე აღდგენა, სინათლის ზემოქმედება და მემბრანული პოტენციალი. მეოთხე: ზონდები საკუთარ კომპარტმენტს ასახავს. MitoCLox-ის დაჟანგვა აჩვენებს, რომ მიტოქონდრიული ლიპიდური რადიკალები წარმოიქმნა; ის არ აჩვენებს, რომ პლაზმური მემბრანის გახეთქვა — სავარაუდო საბოლოო მოვლენა — უშუალოდ იქნა აღკვეთილი და არა წინა ეტაპზე მოქმედებით თავიდან აცილებული.
ამიტომ დასაბუთებული დასკვნა ასეთია: ამ მოდელებში I კომპლექსიდან წარმოქმნილი ROS რკინასთან ერთად იწვევს მიტოქონდრიული ლიპიდების პეროქსიდაციას, რომელიც ფეროპტოზს წინ უსწრებს, ხოლო დაბალი კონცენტრაციის მეთილენის ლურჯი ამ მონაკვეთს წყვეტს. ამ მონაკვეთის ფარგლებს მიღმა ნებისმიერი დასკვნისთვის საჭიროა სხვა ექსპერიმენტები ჯერ ცხოველებზე, შემდეგ კი ადამიანებზე.