Apa biru metilena bisa ngliwati Kompleks III mitokondria? Sebabe panaliten ora sarujuk

Rong laboratorium nliti apa biru metilena bisa ngliwati Kompleks III mitokondria sing diblokir. Siji mangsuli ora. Sijine mangsuli bisa. Loro-lorone duwe data.

Panaliten kapisan, ing mitokondria otak mencit, nemokake yen zat warna kasebut ora bisa. Panaliten kapindho, ing mitokondria otak saka telung spesies rodensia, nemokake yen zat warna kasebut bisa ngliwati blokir kanthi parsial. Panaliten katelu, ing ati mencit, kerep dikutip ing konteks sing padha, nanging nguji bab liya. Yen panaliten kasebut dilebokake ing konteks sing trep, separo saka kebingungan iki bisa ilang.

Ora ana mekanisme universal sing bisa diumumake. Ana telung eksperimen kanthi zat pamblokir, dosis, lan parameter pangukuran sing beda. Wacanen kahanan eksperimene dhisik. Dudutane banjur bisa dimangerteni.

Tegese ngliwati blokir ing kene

Elektron mlebu ing rantai liwat Kompleks I (saka NADH) utawa Kompleks II (saka suksinat), ngliwati Kompleks III menyang sitokrom c, banjur liwat Kompleks IV menyang oksigen. Gradien sing kawangun sajrone proses kasebut digunakake sel kanggo nggawe ATP.

Pratelan yen biru metilena bisa ngliwati blokir ateges biru metilena njupuk elektron ing sisih sadurunge blokir lan masrahake ing sisih sawise blokir. Zat warna sing kaoksidasi nampa elektron saka NADH utawa komponen wiwitan rantai, banjur dadi leukometilena biru, lan wujud sing kareduksi masrahake elektron kasebut menyang sitokrom c utawa bali menyang rantai. Yen elektron dipasrahake ing sisih sawise blokir, respirasi lan potensial membran pulih kanthi parsial. Yen dipasrahake ing papan blokir utawa ing sisih sadurunge blokir, ora ana sing pulih.

Siji rincian Kompleks III dadi penentu akeh bab ing padudon iki. Kompleks kasebut nindakake siklus Q kanthi rong situs inhibitor. Antimycin ngiket situs Qi. Myxothiazol ngiket situs Qo. Panaliten sing mung nggunakake salah sijine mung nguji separo saka kompleks kasebut.

Panaliten kapisan: ora ana jalur sing ngliwati blokir ing mitokondria otak mencit

Gureev lan kanca-kancane nggunakake mitokondria korteks saka mencit C57BL/6, diisolasi nganggo digitonin, banjur diuji ing konsentrasi 0.1 mg protein per ml. Substrat nyakup telung kahanan: piruvat ditambah malat, saben-saben 5 mM, suksinat 10 mM ditambah glutamat 2 mM, lan L-prolin 10 mM. Zat pamblokire yaiku rotenone 1 micromolar (Kompleks I) lan antimycin 1 microgram per ml (Kompleks III). Dosis zat warna yaiku 0.5, 1, lan 2 micromolar, kanthi 1 micromolar minangka konsentrasi utama. Metode lan rekaman pangukurane ana ing laporan FEBS Letters.

Jalur sing ngliwati blokir Kompleks I kasil. Rotenone nyuda respirasi sing dirangsang ADP saka watara 121 dadi watara 2 nmol per minute per mg, lan zat warna 1 micromolar mulihake dadi watara 21. Potensial membran pulih kanthi piruvat ditambah malat lan kanthi L-prolin.

Jalur sing ngliwati blokir Kompleks III ora kasil. Antimycin nyuda respirasi dadi watara 16, lan zat warna mung mundhakake dadi watara 20. Potensial membran ora pulih ing substrat apa wae, nganti dosis zat warna 5 micromolar. Data peroksida uga nuduhake arah sing padha: zat warna tanpa zat pamblokir mundhakake emisi peroksida saka laju basal cedhak 76 pmol per minute per mg dadi watara 1170, 1460, lan 1945 ing telung dosis kasebut, nanging antimycin nyuda sinyal sing dipicu zat warna kasebut watara 25, 88, lan 96 persen, manut urutane. Yen zat warna sing kareduksi langsung bereaksi karo oksigen, pamblokiran Kompleks III mesthine ora nyuda sinyal kasebut. Para panulis nyimpulake yen zat warna sing kareduksi kaoksidasi ing situs Qo Kompleks III, ing sisih sadurunge blokir antimycin. Puteran cekak kasebut bisa diterangake mangkene: donor menyang zat warna, zat warna menyang Qo, banjur diterusake liwat jalur lumrah. Blokir rotenone bisa diliwati. Blokir antimycin ora bisa.

Panaliten kapindho: blokir bisa diliwati kanthi parsial ing telung spesies, ing loro situs inhibitor

Svab lan kanca-kancane nggedhekake rancangan eksperimen. Mitokondria otak saka mencit, tikus, lan marmut diisolasi nganggo Percoll, banjur diuji ing konsentrasi sing padha, 0.1 mg per ml, nganggo piruvat ditambah malat utawa glutamat ditambah malat, saben-saben 5 mM. Dheweke nggunakake rong zat pamblokir Kompleks III: antimycin A 0.3 micromolar lan myxothiazol 1 micromolar. Zat warna digunakake ing konsentrasi 2 micromolar ing umume uji, lan 0.5 ing uji sitokrom c. Data telung spesies kanthi protokol sing padha ana ing artikel akses kabuka.

Loro blokir kasebut bisa diliwati kanthi parsial ing telung spesies. Ing mitokondria mencit, antimycin nyuda respirasi lan zat warna mundhakake watara 60 persen, saka watara 37 dadi 59 nmol per minute per mg. Myxothiazol nyuda respirasi 88 persen, dadi watara 4.5, lan zat warna mundhakake kaping lima dadi watara 23. Potensial membran ngalami repolarisasi parsial ing saben inhibitor, sing diukur nganggo rong zat warna (safranin O lan TMRM rasiometrik) kanggo nyingkirake artefak optik.

Artikel iki uga nguji pasrah elektron kanthi langsung, sing ora tau ditindakake panaliten kapisan. Sitokrom c eksogen sing diasetilasi ing konsentrasi 25 micromolar ora kareduksi dening mitokondria sing duwe energi, kanthi utawa tanpa inhibitor, nanging tambahan zat warna nyurung reduksi ing loro kahanan kasebut. Ing larutan penyangga tanpa sel, NADH ditambah zat warna ngreduksi sitokrom c kanthi laju sing sebanding karo NADH. Lompatan sing luwih adoh kasebut bisa diterangake mangkene: ekuivalen reduksi menyang zat warna, zat warna langsung menyang sitokrom c, banjur Kompleks IV menyang oksigen. Jalur kasebut ngliwati sakabehe Kompleks III, mula blokir saka loro zat pamblokir bisa diliwati.

Rong pangukuran tambahan nyengkuyung interpretasi kasebut. Fluoresensi NAD(P)H mudhun nalika zat warna ditambahake menyang mitokondria sing diwenehi myxothiazol, sing ateges ekuivalen reduksi mili liwat jalur anyar. Absorbansi zat warna ing 660 nm uga ngetutake saben tambahan kanthi urut, dene supernatan sawise sentrifugasi nuduhake yen zat warna sing kaoksidasi nglumpuk ing njero mitokondria sing duwe energi kanthi konsentrasi luwih saka satus kaping, banjur metu nalika potensial ambruk. Petungan proton uga cocog: ngliwati tahapan pemompaan mung nyisakake watara 2 proton saben pasangan elektron, tinimbang 10, mula panggunaan oksigen sing luwih cepet kanthi repolarisasi sing mung parsial pancen dadi tandha jalur sing bisa ngliwati blokir, dudu bukti sing mbantah anane jalur kasebut.

Preparat sing padha ngasilake respons sing gampang disalahwaca yen diwaca kanthi sembrana. Kanthi inhibitor ditambah zat warna, ADP malah nyuda respirasi tinimbang mundhakake, lan pamblokiran transpor malah ngrangsang respirasi tinimbang nyuda, dene potensial membran isih owah ing arah sing lumrah. Konsumsi oksigen wae bisa nyasarke ing sistem iki.

Panaliten katelu: panaliten ati sing nguji Kompleks I lan II, dudu III

Lee lan Boelsterli nggunakake mitokondria ati mencit lan hepatosit sing dikultur, sing rusak amarga efavirenz (Kompleks I, IC50 cedhak 30 micromolar) lan hidrazin, metabolit isoniazid (Kompleks II, IC50 cedhak 30 micromolar). Zat warna ing konsentrasi watara 30 micromolar mulihake oksidasi NADH, potensial membran, lan ATP, nalika nyuda oksidan lan pati nekrotik. Artikel Redox Biology nggambarake proses kasebut kanthi model zat warna nggawa elektron liwat jalur alternatif sing ngliwati Kompleks I lan II sing rusak.

Asil kasebut dadi konteks ing bagean wiwitan rantai sing wis disarujuki, lan ora menehi informasi bab Kompleks III amarga ora ana pamblokiran ing kompleks kasebut. Asil iki ora bisa ngonfirmasi utawa mbantah salah siji saka rong panaliten otak kasebut.

Matriks kahanan eksperimen

Papat sebab loro panaliten Kompleks III bisa bener ing kahanan eksperimene dhewe-dhewe

1. Zat pamblokir kasebut dudu intervensi sing padha. Antimycin tanpa zat pamblokir liyane ing konsentrasi 1 microgram per ml dibandhingake karo antimycin 0.3 micromolar lan zat pamblokir situs Qo sing kapisah. Jalur zat warna sing masrahake elektron menyang situs Qo gagal ing papan sing bisa diliwati kanthi kasil dening jalur langsung menyang sitokrom c. Siji situs ora bisa makili loro-lorone.

2. Dosis zat warna lan wektu pangukuran beda. Konsentrasi utama 1 dibandhingake karo 2 micromolar, ing zat sing muter antarane kahanan redoks lan sing panyerepane sarta reduksi langsung sitokrom c gumantung marang konsentrasi lan wektu. Beda dosis sing cilik ditambah wektu pangukuran sing beda bisa nuduhake bagean sing beda saka jaringan sing padha.

3. Preparat kasebut beda. Isolasi nganggo digitonin dibandhingake karo isolasi nganggo gradien Percoll milih populasi mitokondria sing tumpang tindih nanging ora persis padha. Konsentrasi protein padha, 0.1 mg per ml, mula variabel kasebut bisa disingkirake, nanging subpopulasi lan integritas mitokondria ora bisa. Lan dugaan yen spesies dadi panyebab uga wis disingkirake: klompok kapindho ngasilake maneh fenotipe sing ditemokake ing mencit uga.

4. Kahanan substrat nemtokake apa sing bisa ditindakake zat warna. Telung kahanan substrat dibandhingake karo pasangan substrat sing gegayutan karo NADH. Pasokan NADH lan potensial membran bebarengan nemtokake sepira cepete zat warna kareduksi lan ing ngendi zat warna kasebut sumebar, lan jalur sing mbutuhake zat warna kareduksi ing cedhake sitokrom c kaoksidasi gumantung marang pilihan kasebut.

Cara maca pratelan sabanjure bab ngliwati blokir

Takona kompleks endi sing diblokir, nganggo inhibitor apa, ing situs endi lan dosis pira. Takona konsentrasi zat warna lan kapan pangukuran ditindakake. Takona jaringan, spesies, cara isolasi, konsentrasi protein, lan substrate. Lan takona apa potensial, respirasi, kahanan redoks, lan uji pasrah elektron langsung nuduhake asil sing selaras, amarga konsumsi oksigen wae luwih saka sapisan menehi pratandha sing salah ing kene.

Dudutan sing winates iki tetep sah. Jalur zat warna sing ngliwati blokir Kompleks I wis disarujuki. Ing Kompleks III, mitokondria mencit kanthi antimycin 1 microgram per ml lan zat warna 1 micromolar ora nuduhake jalur alternatif sing bisa mulihake fungsi, dene telung spesies kanthi antimycin 0.3 micromolar utawa myxothiazol 1 micromolar lan zat warna 2 micromolar nuduhake yen blokir bisa diliwati kanthi parsial kanthi transfer langsung saka zat warna menyang sitokrom c. Rong pratelan kasebut bisa padha-padha sah. Pratelan sing luwih amba saka iku minangka ekstrapolasi.

Wacan sing gegayutan njaga pratelan sing isih dirembug iki tetep ana ing konteks kimia sing wis disarujuki: carane biru metilena mindhah elektron kanggo proses pasrah elektron kanthi estafet, eksperimen ngliwati blokir Kompleks I kanggo kasus ing bagean wiwitan rantai sing wis disarujuki, pangukuran potensial membran lan artefake kanggo nerangake sebabe rong zat warna dibutuhake, lan penanganan zat sing muter antarane kahanan redoks ing laboratorium kanggo mangerteni jebakan dosis lan wektu.