Alternatif Methylene Blue kanggo Mikroskopi

Kanggo apusan bakteri sing prasaja, crystal violet bisa ngganti methylene blue yen tujuwane kanggo ndeleng wujud sel. Kanggo sel urip, alternatif sing luwih cocog bisa wae phase contrast tanpa pewarna babar pisan. Pilihane gumantung marang pengamatan sing perlu ditindakake.

Upamane ana wong loro sing mriksa kultur bakteri sing padha. Sing siji pengin mbedakake sel wujud batang saka sel bunder. Sing liyane pengin ngerti apa sawijining perlakuan wis mateni bakteri. Pewarna sing menehi gambar cetha kanggo wong kapisan bisa uga ora menehi jawaban sing migunani kanggo wong kapindho.

Sadurunge milih pengganti, rampungna ukara iki: “Aku perlu ngamati ___ ing ___, lan sel kudu / ora perlu tetep urip.” Ukara kuwi nemtokake tugas sing kudu ditindakake dening pewarna.

Wiwiti saka spesimen lan pitakone

Kaping pisan, temtokake apa sel kudu tetep urip, banjur temtokake fitur sing perlu diamati:

Sel kudu tetep urip: kanggo gerakan utawa wujud, pertimbangna phase contrast tanpa pewarna utawa DIC; kanggo DNA inti, pertimbangna Hoechst 33342 kanthi fluoresensi; kanggo integritas membran, pilih assay sing wis divalidasi kayata SYTO 9 kanthi propidium iodide.
Sel ora perlu tetep urip: kanggo morfologi bakteri, pertimbangna pewarnaan prasaja nganggo crystal violet utawa pewarnaan negatif nganggo nigrosin; kanggo reaksi Gram, gunakna metode pewarnaan Gram lengkap; kanggo DNA inti ing sel sing wis difiksasi, pertimbangna fluoresensi DAPI.

Gunakna tabel iki kanggo mbandhingake watesan saben cabang. Iki pilihan metode, dudu pandhuan kanggo ngganti botol reagen ing protokol sing wis ana.

Apa sing perlu diamati	Spesimen lan piranti	Alternatif calon	Watesan utama
Wujud lan susunan bakteri	Apusan bakteri sing wis disiapake; brightfield	Pewarnaan prasaja crystal violet	Nuduhake morfologi; ora netepake reaksi Gram utawa viabilitas.
Garis njaba sel ing latar peteng	Preparasi bakteriologis; brightfield	Pewarnaan negatif nigrosin	Preparasi lan formulasi penting; sel sing ora kawarna ora mesthi urip.
Reaksi Gram	Apusan bakteri sing wis disiapake; brightfield	Metode pewarnaan Gram lengkap	Mbutuhake urutan reagen lengkap lan kontrol.
Gerakan utawa owah-owahan ing sel urip	Preparasi teles sing kompatibel; phase contrast utawa DIC	Tanpa pewarna	Mbutuhake optik sing cocog; kontras ora ngenali molekul.
DNA inti	Sel sing wis difiksasi; fluoresensi	DAPI	Mbutuhake filter eksitasi lan emisi sing kompatibel.
DNA inti ing sel urip	Sel urip; fluoresensi	Hoechst 33342	Bisa mlebu sel ora mbuktekake yen kondisi pencitraan ora mbebayani.
Integritas membran bakteri	Bakteri tanpa fiksasi; fluoresensi	SYTO 9 kanthi propidium iodide	Pewarnaan membran minangka ukuran viabilitas sing ora langsung.

Kanggo apusan prasaja, ganti metode kanthi ngati-ati

Crystal violet minangka calon praktis yen tugase yaiku ndeleng morfologi bakteri kanthi siji werna. Bacteriological Analytical Manual saka FDA nyathet rong formulasi crystal violet sing cocog kanggo pewarnaan prasaja. Gunakna formulasi sing terdokumentasi lan cara preparasine; jeneng pewarna wae ora cukup kanggo nemtokake reagen kerja.

Crystal violet uga digunakake ing pewarnaan Gram, nanging kuwi ora ateges pewarnaan prasaja nganggo crystal violet padha karo pewarnaan Gram. Ing protokol pewarnaan Gram ASM, asil diferensial gumantung marang crystal violet, iodine, dekolorisasi, lan counterstaining sing tumindak kanthi urut. Yen langkah-langkah kuwi dilirwakake, informasi sing bisa ditetepake saka gambar bakal owah. Delengen pewarnaan prasaja dibandhingake pewarnaan Gram kanggo mbedakake loro kasebut.

Nigrosin menehi cara liya kanggo nuduhake garis njaba: latar mburi dadi peteng nalika sel bakteri tetep relatif padhang. Ana rincian migunani ing pandhuan nigrosin saka Merck sing bisa ora kacathet ing dhaptar pengganti umum. Formulasi kerja sing ditemtokake ngemot formaldehyde. Mula, kompatibilitas karo sel urip ora bisa disimpulake mung saka tembung “pewarnaan negatif,” senajan sel kasebut katon ora kawarna. Priksa formulasi lengkap lan preparasi spesimene.

Kanggo spesimen urip, pertimbangna ngganti optik

Yen pengin ndeleng sel obah utawa mbelah, nambah pewarna liyane bisa nggawe pengamatan luwih rumit. Kaya diterangake Nikon ing pandhuane babagan kontras ing spesimen transparan, phase contrast lan differential interference contrast, utawa DIC, nggawe spesimen katon liwat bedane sifat optike. Metode kasebut bisa nuduhake sel urip tanpa pewarna, yen mikroskop nduweni komponen sing dibutuhake.

Pilihan iki njaga preparasi tetep tanpa pewarna, nanging ngganti informasi sing kasedhiya. Sampeyan bisa ngetutake wates sel utawa gerakan tanpa ngerti molekul endi sing ngasilake kontras kasebut. Yen pitakone babagan lokalisasi molekuler, pilih metode pelabelan sing cocog.

Kanggo DNA inti, perbandingan pewarna DAPI lan Hoechst saka Invitrogen mbedakake panggunaan umum DAPI kanggo sel sing wis difiksasi saka Hoechst 33342 sing luwih gampang nembus sel lan luwih disenengi kanggo pelabelan sel urip. Loro-lorone mbutuhake piranti fluoresensi. Ora ana siji-sijia sing dadi pengganti langsung kanggo pewarna brightfield sing menehi werna.

Anggep paparan pewarna lan iluminasi minangka kondisi eksperimen. Bandhingna preparasi sing kawarna lan sing ora kawarna yen prilaku sel dadi ukuran sing diamati.

Sel abang ora kanthi otomatis ateges sel mati

SYTO 9 lan propidium iodide kerep dipasangake kanggo netepake integritas membran bakteri. Manual BacLight nggandhengake membran sing utuh karo pewarnaan ijo lan membran sing rusak karo pewarnaan abang. Interpretasi kasebut perlu divalidasi kanggo spesimen sing digunakake.

Sawijining panaliten taun 2019 dening Rosenberg lan kolega nuduhake masalah iki. Ing biofilm E. coli umur 24 jam ing kaca sajrone phosphate-buffered saline, kira-kira 96% sel katon positif propidium iodide kanthi in situ. Nanging, para penulis ngira yen 82% isih bisa dikultur sawisé dipanen. Gambar confocal nuduhake sel kanthi bagian njero ijo ing sangisore bahan sing kawarna abang, sing nuduhake yen asam nukleat ekstraseluler melu nyebabake sinyal sing nyasarke.

Persentase kasebut nggambarake pangukuran sing beda ing preparasi panaliten kasebut, dudu faktor koreksi universal. Piwulang sing migunani yaiku mriksa apa sing ngasilake sinyal kasebut. Ing biofilm, pewarna asam nukleat bisa ndeteksi bahan ing njaba sel uga ing njero sel sing rusak. Kanggo kesimpulan babagan viabilitas, para peneliti nyaranake pangukuran pelengkap, kayata kultivasi utawa aktivitas metabolik, kanthi ngakoni manawa saben metode nduweni watesan.

Priksa apa sing sejatine ana ing alternatif

Metode pewarnaan alternatif bisa uga isih ngemot methylene blue. Giemsa minangka salah sawijining conto: Merck njlentrehake produke minangka larutan azure-eosin-methylene-blue, sing ditujokake kanggo aplikasi kalebu apusan getih lan sumsum balung. Iki bisa dadi metode sing beda kanggo spesimen sing beda, nanging ora nyukupi syarat kanggo nyingkirake methylene blue.

Yen ngilangi sawijining senyawa dadi bagean saka eksperimen, priksa identitas lan formulasi reagen sadurunge mbandhingake gambar. Pandhuan babagan methyl blue, methylene blue, lan pewarna liyane kanthi jeneng sing padha nerangake bedane penamaan.

Verifikasi penggantian sadurunge nggunakake asile

Kanggo metode anyar, gawe perbandingan cilik nganggo spesimen sing makili lan kontrol sing cocog. Yen bisa, jaga setelan mikroskop supaya bisa dibandhingake. Cathet formulasi reagen, preparasi spesimen, paparan, lan kondisi pencitraan supaya gambar sing katon luwih apik bisa diselidiki, dudu mung dipilih amarga penampilane.

Nilai kasil adhedhasar pitakon awal. Kanggo morfologi, nilai apa wates lan susunan sel isih bisa diinterpretasi. Kanggo pelabelan inti, nilai lokasi sinyal lan latar mburi. Kanggo viabilitas, butuhake bukti luwih saka mung pamisahan werna sing katon apik. Pandhuan sing luwih jembar babagan pewarnaan methylene blue lan aplikasi laboratorium nerangake kepiye pengamatan lan preparasi gegandhengan.

Pilih alternatif sing njaga pangukuran sing sampeyan butuhake. Werna mung salah siji sifat saka gambar sing diasilake.