ニューメチレンブルーと網赤血球染色：別種の色素を用いた生細胞の染色法

ある学生が網赤血球の計数に向けて準備し、メチレンブルーを注文して血液と混ぜたところ、ほとんど何も見えませんでした。同級生はニューメチレンブルーと表示された瓶を使い、一部の赤血球内に鮮明な青い糸状構造を確認できました。最初の学生は、同級生の瓶のほうが新しいか、濃度が高いのだろうと考えます。どちらでもありません。含まれている分子が違うのです。

この分野で生じる混乱の多くは、この概念上の誤解に起因します。名前からは、ニューメチレンブルーがメチレンブルーの改良品であるように思えます。しかし、化学的にはそうではありません。ニューメチレンブルーNは別種のフェノチアジン系色素であり、独自のカラーインデックス番号、置換基の配置、血液学における標準化された用途を持ちます。この違いを理解すれば、染色時に細胞が生きている必要がある理由、網赤血球と判定する基準、ハインツ小体の位置づけ、ブリリアントクレシルブルーを使う場面といった、染色法の残りの要点も理解しやすくなります。

要点

血液学用試薬のニューメチレンブルーNは、一般にニューメチレンブルーのPubChemレコードに記載されたBasic Blue 24として同定され、C.I. 52030、CAS 1934-16-3、分子式C18H22ClN3Sで示されます。通常のメチレンブルーは、PubChemレコードに記載された塩化メチルチオニニウム、Basic Blue 9であり、C.I. 52015、CAS 61-73-4、分子式C16H18ClN3Sです。構造上、ニューメチレンブルーは環上に2つのメチル基を持ち、メチレンブルーがジメチルアミノ基を持つ位置にエチルアミノ側鎖を持ちます。この違いによって染色特性が変わります。血液学の教科書では、通常のメチレンブルーは網赤血球の染色性が比較的低く、ニューメチレンブルーはより濃く均一に染色するとされています。この比較は、ScienceDirectのニューメチレンブルーに関する解説にまとめられています。

ニューメチレンブルーは超生体染色用の色素です。超生体染色とは、体外に取り出した生きた細胞を、固定する前に染色することを指します。この定義は、NCBIの超生体染色の原理に関するレビューに示されています。ニューメチレンブルーとブリリアントクレシルブルーはいずれもこの分類に属し、CLSIの網赤血球標準では、ニューメチレンブルーを超生体染色用色素として明示的に扱っています。学生は、この方法を固定塗抹標本のロマノフスキー染色と同じ枠組みで捉えることがあります。しかし、その理解はここでは通用しません。先に固定すると、この方法は機能しなくなります。

似た名前の色素を整理したい場合は、メチルブルーとメチレンブルーの違いで、陰イオン性トリアリールメタン系色素と陽イオン性フェノチアジン系色素の間にある、別の、より大きな混同を解説しています。実験室での染色法の概要では、固定塗抹標本を用いる方法とあわせて超生体染色の位置づけを示しています。また、血球形態ガイドでは、より広範な血球分類の中で網赤血球の評価がどこに位置するかを説明しています。

カタログを見る際には、注意点が1つあります。ニューメチレンブルーには、CAS 6586-05-6で示される別の塩化亜鉛複塩の形態も存在します。そのため、方法の記載では一般名だけでなく、塩の形態と供給元も明記する必要があります。

超生体染色で実際に起こること

網赤血球は、核を失ったものの、リボソームRNAが残っている若い赤血球です。未染色の湿潤標本では、このRNAは見えません。超生体染色用色素は生きた細胞に入り、そのRNAを沈殿または凝集させて青い顆粒や糸状構造にします。これが、油浸観察で見える網状・糸状物質です。したがって、この網目構造は染色によって生じるものであり、あらかじめ存在する骨格に色が付くわけではありません。このため、色素濃度、緩衝液、血液と色素の比率、温度、時間といった手順上の変数は、色素名と同じくらい重要です。

実際の操作では、順序を厳守する必要があります。まず抗凝固処理した血液を色素と混ぜ、インキュベートした後に塗抹標本を作製し、固定も対比染色もせずに観察します。染色前の固定や、淡い糸状構造を覆い隠す対比染色を行うと、計数の根拠となる情報が失われます。

ニューメチレンブルーを用いた網赤血球染色の実用的な手順

すべてに共通する単一の処方はないため、使用した処方を報告してください。文献に記載された3つの方法を見ると、その幅がわかります。

古典的なBrecher型の手順では、シュウ酸カリウムを含む約0.5パーセントのニューメチレンブルー溶液を、十分に混和したEDTA血液と等量で混ぜ、室温で約10～15分間インキュベートします。穏やかに再混和した後、薄い楔状塗抹標本を作製し、風乾させ、固定せずに100x油浸対物レンズで観察します。NCBIの網赤血球計数手順では、この操作の流れと、併用する計数枠を説明しています。

Dacie and Lewisの方法では、クエン酸塩加生理食塩液中の1.0パーセントのニューメチレンブルーを用い、その2～4倍量の血液と混ぜ、37 Cで15～20分間保持してから塗抹標本を作製します。CLSI H44手順の調和化を実施した最近の例では、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩液中の、より低濃度の0.1パーセント溶液を用い、20 Cで10分間インキュベートし、固定は行っていません。この方法は、2026年のNMB調和化研究で報告されています。

計数基準は、いずれの方法でも共通しています。青く染まる明瞭な顆粒または糸状構造の断片が少なくとも2つ認められる細胞を網赤血球と判定します。これにより、孤立した染色沈着物を除外できます。通常の検査では少なくとも1,000個の赤血球を数え、網赤血球を百分率で報告します。割合が低い場合は、統計的により多くの細胞を数える必要があります。CLSI H44の方法論に関するレビューでは、網赤血球が約1パーセントの場合、計数変動を5パーセントに抑えるには約4,400個の細胞が必要とされています。詳しくは、De GruyterのCLSI H44レビューに記載されています。Miller接眼ディスクを使うと、多数の細胞を実用的に計数できます。沈殿物は顆粒状の封入体に似て見えるため、色素溶液はろ過するか、使用時に新しく調製してください。

同じ標本で観察できるハインツ小体

同じ超生体染色の塗抹標本で、ハインツ小体も確認できます。ハインツ小体は残存RNAではなく、酸化・変性したヘモグロビンの凝集体です。ニューメチレンブルー標本では円形の小体として見え、単独で膜の近くに認められることが多く、網状・糸状物質より淡い青色に染まります。固定や対比染色を行うと保持されにくいため、未固定の塗抹標本を観察してください。最近の手順では、20マイクロリットルのEDTA血液に20マイクロリットルの1パーセントのニューメチレンブルーを加え、15分間インキュベートした後、250個の赤血球中のハインツ小体陽性細胞を定量しています。この手順は、PMCに掲載された研究で報告されています。

誤読を防ぐために、2つの違いを区別する必要があります。第1に、メチルバイオレットとクリスタルバイオレットは、ニューメチレンブルーよりもハインツ小体を濃く染色します。これは、ScienceDirectのハインツ小体に関する解説に記載されています。ニューメチレンブルーは、網赤血球とハインツ小体を同時に評価する際には便利ですが、ハインツ小体専用の色素として最も強く染めるものではありません。第2に、αサラセミア形質におけるHbH封入体は、超生体染色後に細胞全体に多数の微細な点として現れます。一方、典型的なハインツ小体は数が少なく、より大きく、膜に接していることが多くあります。3つ目の類似物は染色沈着物です。これは細胞と同じ焦点面にはなく、視野によって見え方が異なります。

ブリリアントクレシルブルーとニューメチレンブルーの比較

どちらも網赤血球の超生体染色に用いる色素ですが、標準化では一方が優先されています。国際血液学標準化協議会と共同で策定され、CLSI H44標準のページに掲載されているCLSI H44-A2網赤血球測定法では、EDTA血液をニューメチレンブルーで染色する方法を、用手法による比較法として指定しています。従来の血液学教育でも、染色像について同様に説明されています。ニューメチレンブルーは糸状構造をより濃く均一に染める一方、ブリリアントクレシルブルーはロット間や検体間でのばらつきが大きくなります。

ただし、この位置づけには補足が必要です。ICSHの分析装置評価ガイドラインは、ニューメチレンブルー染色による用手顕微鏡法を参照比較の方法として認めていますが、主観的で精密度が比較的低いと述べ、利用可能であればフローサイトメトリーによる参照手順を優先しています。100検体を比較した2022年の研究では、使用した分析装置に対するバイアスは、ニューメチレンブルーよりもブリリアントクレシルブルーのほうが小さいと報告されています。この結果は、PMCに掲載された染色法の比較研究に記載されています。学生向けには、ニューメチレンブルーを標準化された用手法の比較基準として使い、施設で用いるブリリアントクレシルブルー法はその基準または自動測定法と比較して検証し、どちらの色素でも用手顕微鏡法には大きなばらつきがあると理解するのが妥当です。古い標準化文献では、市販色素のロット間で差があるため、化学的により純度の高い代替物として精製Azure Bの使用も提唱されていました。Azure Bに関するMarshallの研究にその記載があり、試薬のグレードが今も方法論の議論に登場する理由がわかります。

よくある誤りを避ける

標本作製の失敗の多くは、4つの誤りで説明できます。ニューメチレンブルーNの代わりに通常のメチレンブルーを注文すると、技術ではなく化学的性質のために染色が弱くなります。観察前に固定や対比染色を行うと、超生体染色の所見が失われます。色素の沈殿物を顆粒として数えると、結果が過大になります。これは、顆粒を2つ以上とする基準と、色素溶液のろ過によって防げます。網赤血球の割合が低いのに計数する細胞が少なすぎると、見かけ上は精密でも、信頼限界の幅が広い数値になります。これらの誤りには共通点があります。試薬を扱う段階で決まった結果を、観察者が顕微鏡のせいにしてしまうことです。