レフラーのアルカリ性およびポリクロームメチレンブルー染色の解説

染色台の上に3本のボトルが並び、それぞれにメチレンブルーの何らかの名称が表示されていることがあります。1本には1%水性メチレンブルーと書かれています。1本にはレフラーのアルカリ性メチレンブルーと書かれています。1本にはポリクロームメチレンブルーと書かれています。忙しい作業者は最も近いものを手に取ります。その結果、塗抹標本の染色が薄すぎたり、均一な青色になったり、予想外の紫色の色調になったりし、その原因が試料にあると考えられることがあります。

これは試料の問題ではなく、処方の問題です。3種類の溶液は関連する色素を含みますが、それぞれ異なる染色概念を体現しています。1つはほぼ中性pHの単純な陽イオン性色素です。1つはアルカリによってより強く作用するようにした同じ色素です。1つはもはや単一の色素ではなく、意図的に酸化された混合物です。誤ったものを使用すると、染色原理そのものが手元で変化します。

短い答え

通常の水性メチレンブルーは基準となる処方です。約1%の色素を水に溶かしたもので、細菌形態や一般的な顕微鏡観察に用いる単純な陽イオン性色素染色です。レフラーのアルカリ性メチレンブルーは、水で希釈したアルコール性ストック液に少量の希アルカリを加えたもので、pHを上昇させ、陽イオン性色素を酸性の細菌構造へより強く作用させます。ポリクロームメチレンブルーは、アルカリ条件下で意図的に熟成（酸化）させたメチレンブルーであり、そのボトルには残留メチレンブルーに加えて、脱メチル化された同族体（azure A、azure B、azure C）、チオニン、メチレンバイオレットが含まれ、その混合物によって異なる構造を異なる色調で染色します。

1文だけ覚えるなら：アルカリ化は染色強度を変化させ、ポリクローム化は染色色を変化させます。

通常の水性メチレンブルー：基準点

最も単純な処方は、アルカリを加えず、酸化もさせずにメチレンブルーを水に溶解したものです。一般的には1% w/vで使用されます。有色種はメチルチオニニウム陽イオンで、塩化物を対イオンとする小さく平坦なフェノチアジン系色素であり、PubChemのメチレンブルー記録ではmethylthioninium chlorideとして説明されています。陽イオンであるため、核酸のリン酸骨格や細菌細胞壁の酸性基に結合し、細胞を明るい背景に対して青く染色します。

この処方の長所は予測可能性です。核や細菌は青色に見えます。コントラストは中程度です。微弱な生物は弱く染色されることがあり、これこそがレフラー法が解決しようとした制限でした。この溶液が属する単純細菌染色の広い分類については、細菌単染色の概要を参照してください。ここでも同一性の管理は重要です。methyl blueはまったく異なる分子であり、methyl blue versus methylene blueで説明されているように、色名だけでカタログ検索を行うと誤った色素分類の商品が表示される可能性があります。

レフラーのアルカリ性メチレンブルー：同じ色素を強く作用させる

古典的なレフラー処方は、アルコール性メチレンブルーストック液と希アルカリを水中で組み合わせます。教科書的な処方では、95%エタノール30 mL中の色素0.3 gに、0.01%水酸化カリウム水溶液100 mLを加える（または飽和アルコール性メチレンブルー30 mL、蒸留水100 mL、1% KOH 1 mLと同等）とされ、明確にアルカリ性のpHで約0.3%色素の作業液になります。市販品も同じ原理に基づいており、Thermo Fisher microbiology stains catalogでは、レフラーのアルカリ性メチレンブルー、ポリクロームおよび水性タイプを、異なる用途を持つ別々のカタログ品目として掲載しています。

アルカリが中心となる考え方です。pHを上げることで試料中のカルボキシル基やリン酸基が脱プロトン化され、負電荷部位の密度が増加します。一方、エタノールストックは色素を完全に溶解した状態に保ち、単量体形態でその部位へ到達させます。その結果、中性の水性色素よりも細菌を速く、強く染色し、通常の細菌塗抹標本で見られる濃い青色の桿菌や球菌が得られます。染色時間は通常1〜3分で、その後水洗します。

古典的な用途は、レフラー血清培地で培養したCorynebacterium diphtheriaeです。細長く、しばしば棍棒状の桿菌が、保存されたポリリン酸による強く染色されたBabes-Ernst顆粒を伴って観察されます。培地と染色法の組み合わせは歴史的なものであり、どちらも同じ細菌学者に関連付けられており、顆粒のコントラストがその成果です。ジフテリア研究以外でも、この染色法は培養物からの塗抹標本の一般細菌染色、臨床塗抹標本におけるNeisseria形態観察、グラム染色が不要でありながら通常の水性青色染色では薄すぎる場合に使用されます。これは単色染色です。酸性のものはすべて青色の範囲で染まります。差別的な色分けが必要な場合、アルカリだけではそれを実現できません。

実用上の注意点として、アルカリ性色素溶液は保存中や二酸化炭素吸収によって劣化し、沈殿を生じます。研究室では少量を調製するか、市販のカタログ溶液を購入して使用期限を守り、古いボトルから沈殿物がすべてのスライドに付着する状態で使い続けることは避けます。

ポリクロームメチレンブルー：1つの名称、複数の色素

ポリクロームメチレンブルーは、同じ色素を出発点とし、アルカリ中で制御された酸化処理を行います。歴史的には熟成またはポリクローム化と呼ばれています。アルカリによる熟成、炭酸塩存在下での加熱、または二クロム酸塩などによる酸化によって、ジメチルアミノ置換基からメチル基が段階的に除去されます。生成物は混合物です。残留メチレンブルーに加えて、azure B（1つのメチル基を失ったもの）、azure Aおよびazure C（さらに脱メチル化したもの）、チオニン（完全脱メチル化したもの）、さらにメチレンバイオレット系の酸化副生成物が含まれます。それぞれの成分は独自の色調と組織親和性を持つため、この混合物はメタクロマジー的に染色します。核、顆粒、ムチン、軟骨はそれぞれ異なる青色から赤紫色の色調を示します。

この化学反応は、有名な血液染色の基礎となった化学反応と同じです。初期の研究者は、アルカリ化したメチレンブルーがマラリア原虫の核を紫色の色調で染色することを発見しましたが、水性の熟成溶液は不安定で数日以内に沈殿しました。how the purple blood stain was inventedのレビューでは、1891年にMalachowskiとRomanowskyが独立してこの効果を利用した経緯、メタノールが色素沈殿を安定化し、加熱せずにフィルムを固定するため導入された経緯、さらにGiemsaが後にグリセロール安定化と測定されたazure Bおよびエオシンを中心とした混合物を標準化した経緯が追跡されています。現代のGiemsa系染色は、Romanowsky効果を生み出す組み合わせである、ポリクロームメチレンブルーとエオシンから直接発展したものです。エオシンとの組み合わせおよびazure B成分の詳細については、Romanowsky-type stains and the azure B eosin interactionを参照してください。

混合物であるため、ポリクロームメチレンブルーは3種類の中で本質的に最も標準化が難しいものです。正確な色調バランスは酸化経路と酸化程度に依存します。そのため、組織学用品メーカーは、単なる熟成したレフラー液としてではなく、性能試験を伴う独立した製品として販売しています。典型的な用途には、肥満細胞顆粒、ムチン、軟骨のメタクロマジー確認、形質細胞の詳細観察、Goodpasture型ポリクローム法による組織切片中のHelicobacter pylori観察などがあります。色による識別が目的なら適切な選択ですが、明確な単色の細菌像を求めるプロトコルでは適していません。

処方と目的の比較

表は判断手順として読むことができます。試料の染色が薄すぎる場合は、pHの考え方を変えてレフラー法を選びます。すべてが染まるものの区別がつかない場合は、色素の概念を変えてポリクローム法を選びます。レフラー染色で顆粒が美しく見える一方、核と細胞質が同じ青色になる理由を問われた場合、その答えはアルカリ性単色染色ではその役割を果たせないためです。その問題はポリクローム系とその血液染色誘導体に属します。

よくある混同を避ける

混乱の大部分は2つの誤りから生じます。1つ目は、レフラー法と通常のメチレンブルーを、どちらもボトル内で青く見えるため同じものとして扱うことです。両者はpHと強度が異なり、レフラー指定の箇所で中性色素を代用すると、プロトコルが意図した顆粒コントラストが失われます。2つ目は、古くなった、または偶然熟成したアルカリ性青色溶液をポリクロームとみなすことです。制御されていない熟成では、濃度不明の未知の混合物が生成されます。一方、真のポリクローム溶液は、定義された酸化経路で調製され、血液染色の系統では測定されたエオシンと組み合わせられます。歴史はここで示唆を与えます。1890年代の不安定な水性熟成溶液は、再現不可能な混合物であったため、メタノール安定化処方へ移行しました。不明な年代のボトルから診断用スライドを染色する前に、この教訓を思い出す価値があります。

名称管理が最後の確認点です。色から推測するのではなく、ラベル上でカタログ品目（水性、レフラー、ポリクローム）、色素含有量、目的用途を確認してください。3つの処方は共通する発色団の祖先を持っています。しかし、目的は共有していません。