メチレンブルーDNA染色：アガロースゲルおよびメンブレンRNA染色

学生がアガロースゲルを泳動し、メチレンブルーで染色するが、明瞭なバンドが見えるはずの場所に何も見えない。隣の実験台では、ポスドクが同じ青いボトルの染色液でNorthernメンブレンを染色し、3分で鮮明なリボソームバンドを得ている。学生はゲルが失敗したと結論づける。ゲルは失敗していない。2つの作業は異なり、同じ色素でも感度、バックグラウンド、そして次に何が起こるかのルールが異なる。

メチレンブルーDNA染色とメチレンブルーRNA染色は化学的性質を共有するが、目的は異なる。ゲルでは、色素は多孔質マトリックス内部に存在する核酸量を示す。メンブレン上では、転写が正常に行われたか、レーン間のロード量が均一かを示す。この違いが明確になれば、プロトコル、検出限界、適合性の制限が整理される。

短い回答

メチレンブルーは平面状のカチオン性染料であり、静電的なリン酸基への引力、塩基対間へのインターカレーション、マイナーグルーブへの結合の組み合わせによって、核酸に非共有結合的かつ可逆的に結合する。この可逆性が重要である。バンドは可視光で染色、記録した後、クローニング、ハイブリダイゼーション、再プロービングのために脱色または洗浄できる。

二本鎖DNAのメチレンブルーアガロースゲル染色では、標準的な迅速プロトコルは水中で0.02パーセント w/v（200 micrograms per mL）、約15分間の染色、約15分間の水による脱色であり、白色光ボックスで観察する。メンブレンでは、古典的なNorthernブロットプロトコルはpH 5.2付近の酢酸ナトリウム中0.02〜0.04パーセント色素を使用し、転写および固定化後に数分間染色し、その後水洗浄と完全な脱色を行ってからハイブリダイゼーションを実施する。感度は中程度であり、良好な条件ではゲルバンドあたり数十〜数百ナノグラム、保守的なガイドでは0.5〜1 microgramが示されている。これはエチジウムブロマイドやSYBR染色より数桁低い感度である。メンブレンでは、この染色は主に豊富なリボソームRNAと総ロード量を示すため、単一転写産物の有用な検出限界は存在しない。どちらのレシピにも小売用サプリメント溶液を代用してはならない。検証済みの方法では、分析グレードの色素、定義されたバッファー、RNAを扱う場合のRNaseフリー操作を前提としている。

結合の仕組みと誤解を招く点

有用なモデルは3つの要素から成る。第一に、正に帯電した環状系は負に帯電したリン酸骨格に引き寄せられる。分光学的研究では低塩濃度でこの静電的要素が支配的であることが示され、一方でモデリングおよび分子動力学では、メチレンブルーDNA結合の分光学的研究で要約されているように、二本鎖DNAに対する安定した結合様式としてインターカレーションとマイナーグルーブ結合も維持されている。第二に、ある程度のGC選択性が存在し、メチレンブルーのインターカレーション選択性に関する研究ではCpGおよびGpCステップへの選好がモデリングで示され、GCリッチな二本鎖への優先的結合が実験で報告されているが、AT二本鎖にも結合する。通常の染色は配列特異的ではない。第三に、一本鎖DNAおよびRNAは主に静電的相互作用と、アクセス可能な塩基および二本鎖領域とのスタッキングによって結合するため、染色強度は長さ、配列、二次構造によって変化する。

2つの結果が生じる。非共有結合であるため、色素は洗い流される。ポリアクリルアミドバンドは意図的に固定しない限り速やかに退色し、通常の染色が一時的であることから、専用の永久固定バリアントが存在する理由が分かる。これはSotoとDraperによるPAGEゲル研究で説明されている。色素は光増感剤であるため、酸素存在下で染色DNAに長時間強い光を当てると、グアニンを酸化し、最終的に鎖切断を引き起こす可能性があり、その機構はメチレンブルーによるグアニン酸化増感の研究で詳述されている。短時間の白色光観察では、古典的なエチジウムブロマイド工程で知られるUV損傷を避けられ、その利点は調製用回収で実際に有効である。可視光はより穏やかだが、無害ではない。DNAをクローニングする場合は照射時間を短く保つ。より広範な光化学的背景については、メチレンブルー光化学における2つの経路を参照。酸化型が結合し還元型が結合しない理由を説明する酸化還元対と電荷状態については、メチレンブルーの構造と特性の化学を参照。

作業1：ゲル内部での染色

ゲル染色が答える質問は1つである。このバンドには肉眼で確認できる十分な核酸量があるか。アガロース中の二本鎖DNAが最もよく特徴づけられたケースである。Floresらによるメチレンブルーゲル法の原著では、1パーセントアガロース上で0.02パーセント迅速プロトコルが検証され、その後の回収およびクローニング成功が示された。同じ供給元プロトコルは、IBI Scientificメチレンブルー製品ページにも掲載されており、0.04パーセントのメンブレンレシピと迅速ゲルバリアントが並べて記載されている。

実用的なワークフロー：

ゲルを通常通り泳動する。転写または分解能が修正法で検証されていない限り、泳動中ではなく電気泳動後に染色する。
蒸留水中0.02パーセント w/vメチレンブルーに浸し、穏やかに攪拌しながら約15分間染色する。
数回の水交換で脱色し、合計約15分間、マトリックスのバックグラウンドが低下しバンドが目立つまで行う。
白色光イルミネーター上で速やかに撮影する。

アガロースとポリアクリルアミドは異なる挙動を示す。アガロースはマトリックス内に色素を保持するため、脱色が遅い工程になる。薄いポリアクリルアミドゲルは速く染色されるが、色素も速く失うため、調製用切り出しには有利であり、長期記録には不利である。ポリアクリルアミド中の合成オリゴヌクレオチドは、確立されたCurrent Protocols形式のPAGE法に従い、同じ0.02パーセントレシピで20〜30分間、繰り返し水洗浄することで検出できる。希釈TBE中で約0.0002パーセントに近い非常に希薄なバリアントが、数時間かけた調製用オリゴに対して報告されているが、証拠基盤は弱い。

DNAとRNAの違いは重要である。二本鎖DNAは最も強い構造化された結合を示す。RNAおよび一本鎖DNAも染色されるが、より弱く予測性が低い。ホルムアルデヒドアガロースRNAゲルでは、多くの研究室がゲル内青色染色を避け、まずRNAをメンブレンへ移す。その移行により、弱いゲルシグナルを、より鮮明なメンブレンシグナルとロード記録へ置き換える。

作業2：メンブレン上での染色

メンブレン染色が答える質問は異なる。転写は成功したか、レーンは比較可能か、である。古典的な用途はHerrinおよびSchmidtの可逆Northernブロット染色であり、元の方法ではpH 5.0の50 mM酢酸ナトリウム中0.04パーセント色素を2〜3分間使用し、水洗浄後、ハイブリダイゼーション前に希釈SDSを含むSSPEで除去した。

広く使用される現代的なバリアントは以下の通りである：

RNAまたは変性DNAをナイロンまたはニトロセルロースへ転写し、その後UVクロスリンクまたは加熱固定によって固定化する。これにより染色中にサンプルが失われない。
任意だが一般的：メンブレンを5パーセント酢酸中で約15分間湿らせる。
pH 5.2付近の0.3〜0.5 M酢酸ナトリウム中0.02〜0.04パーセントメチレンブルーで5〜10分間染色する。
水で5〜15分間洗浄および脱色し、記録後、ハイブリダイゼーション前に残留色素を除去する。

（以下略）