Metýlenblátt í rannsóknum á sebrafiskum: íblöndunarefni við umhirðu og truflandi tilraunaþáttur

Vatn fyrir sebrafiskahrogn er oft ljósblátt og varla nokkur skráir hvers vegna. Litarefnið er metýlenblátt, sem er bætt í gegn sveppum, og í flestum verklagsreglum er farið með það sem bakgrunnsþátt. Það er rangt hugtak hér. Betra hugtak er óskráður tilraunaþáttur: efni sem er til staðar í meðhöndluðum skálum en ekki í viðmiðum, hefur lyfjafræðilega virkni við þann styrk sem er notaður og getur breytt einmitt þeim mælibreytum sem tilraunin mælir.

Þessi aðgreining er rauði þráðurinn í því sem hér fer á eftir. Hefðbundin sveppavörn við umhirðu er eitt viðfangsefni. Hvort íblöndunarefnið sé hlutlaust gagnvart mæliaðferðinni þinni er annað. Nýlegar rannsóknir á sebrafiskum veita hughreystandi svar við fyrri spurningunni en óþægilegt svar við þeirri síðari.

Hvað leiðbeiningarnar mæla í raun fyrir um

Enginn einn staðall gildir og það er hluti vandans. Leiðbeiningar Canadian Council on Animal Care heimila 0.5 mg/L, eða 0.00005%, í flutningslausn fyrir hrogn og lirfur til að draga úr sveppavexti. Evrópskar leiðbeiningar um tilraunadýr lýsa því að fósturvísar séu hafðir í æti sem inniheldur oft sama styrk, 0.00005%. E3-uppskrift Cold Spring Harbor tilgreinir tvöfaldan þann styrk, 1 mg/L eða 0.0001%, sem innihaldsefni. Á móti þessu stendur áberandi fjarvera: leiðbeiningar OECD um eiturhrifapróf á fiskafósturvísum tilgreina þynningarvatn sem er útbúið með skilgreindri efnasamsetningu og prófunarefnið, en ráðleggja ekki metýlenblátt, hvorki í útgáfunni frá 2013 né síðari endurskoðun. Þannig elur ein rannsóknarstofa sebrafiskafósturvísa í bláu vatni með metýlenbláu frá fyrstu klukkustundum lífsins, önnur framkvæmir fósturvísaprófið samkvæmt reglugerð í tæru vatni, og báðar kalla ætið sitt eðlilegt. Hver sá sem ber saman niðurstöður milli rannsóknarstofa eða sameinar eldri viðmiðunargögn situr uppi með þetta ósamræmi.

Til að setja styrkinn í samhengi eru 0.00005% um 1.56 micromolar og 0.0001% um 3.13 micromolar. Þetta eru lágar tölur og freistandi að túlka þær sem of lágar til að skipta máli. Rannsóknirnar hér að neðan prófa einmitt þá forsendu, við einmitt þennan styrk.

Lesendur sem koma úr fiskabúrahaldi fremur en rannsóknarstofum kynnast sömu sameind í öðru samhengi, sem fjallað er um í leiðbeiningunum um metýlenblátt í fiskabúrum. Efnafræðin er sú sama; umfjöllunin um hvernig litarefnið flytur rafeindir um frumur skýrir hvers vegna oxunar- og afoxunarvirkt efnasamband birtist sífellt í greinum um efnaskipti. Það sem hér fer á eftir á sérstaklega við um vatn fyrir sebrafiskahrogn með metýlenbláu.

Efnaskipti: áhrifin skipta um formerki eftir þroskastigi

Sú rannsókn sem gaf mestar upplýsingar útsetti sebrafiska með eðlilegan þroska frá fyrsta degi lífsins fram að 5 dögum eftir frjóvgun og mældi oxunarefnaskipti á hverju þroskastigi, eins og lýst er í birtri skýrslu um efnaskiptatilraunirnar á fósturvísum. Mynstrinu þarf að lýsa vandlega því það snýst við.

Við 1 dag eftir frjóvgun jókst grunnsúrefnisnotkun í útsettum fósturvísum við báða styrki sem notaðir eru við umhirðu. Við 2 daga var himnuspennan í hvatberum yfirborðslags lirfanna hækkuð við útsetningu fyrir 0.00005%, 0.0001% og 0.0003%. Við 4 til 5 daga, eftir klak, hafði formerkið snúist við: orkunotkun við oxun minnkaði, hvort sem útsetning hafði verið samfelld frá frjóvgun eða aðeins skammvinn frá degi 3 til dags 4. Samhliða fækkaði umritum fyrir undireiningar öndunarflóka hvatbera bæði við 1 og 4 daga, ásamt umritum sem tengjast steramyndun og nýmyndun glúkósa.

Tvær frekari athuganir skerpa myndina. Klak varð örlítið fyrr við hærri umhirðustyrkinn; útsettir fósturvísar voru á undan við 2 daga en viðmið höfðu náð þeim við dag 3. Og streituásinn sjálfur virtist óskertur: þegar 5 daga lirfur voru látnar verða fyrir streitu með hvirflun hækkaði kortisól í öllum líkamanum eðlilega í báðum hópum. Litarefnið er því ekki almennt þroskaeitur við þennan styrk og það dregur ekki úr öllum lífeðlisfræðilegum viðbrögðum. Það breytir orkuefnaskiptum eftir þroskastigi, til aukningar fyrir klak og til minnkunar eftir klak.

Hegðun: hvers vegna tvær rannsóknir eru ósammála og hvers vegna báðar geta haft rétt fyrir sér

Rannsóknir á hegðun virðast mótsagnakenndar þar til útfærslur útsetningarinnar eru bornar saman. Í einni öryggisrannsókn á þroska og hegðun voru fósturvísar útsettir frá um 6 klukkustundum eftir frjóvgun fyrir styrk allt að 10 micromolar. Lausnirnar voru endurnýjaðar daglega til og með degi 4, síðan voru lirfurnar fluttar í litarefnislaust æti á dögum 5 og 6 og hreyfivirkni prófuð með ljóss- og myrkurprófi á degi 6. Niðurstaðan: engin marktæk áhrif á dánartíðni, klak eða formgerð og engin áhrif meðhöndlunar á hreyfivirkni. Höfundarnir mæltu með 10 micromolar sem efri mörkum við sínar aðstæður, sem var eðlileg ályktun.

Annar hópur, með nokkra sömu höfunda og efnaskiptarannsóknin, framkvæmdi útsetninguna eins og hún fer í raun fram við umhirðu: litarefnið var til staðar frá 2 til 3 klukkustundum eftir frjóvgun, lausnin endurnýjuð að hluta daglega og hegðun mæld meðan útsetning stóð yfir eða skömmu eftir hana. Við sömu hefðbundnu styrkina sýndu lirfur minni hreyfivirkni í 24 klukkustunda prófi. Það var endurtakanlegt milli stofna og rannsóknarstofa og rannsóknin á truflandi áhrifum á hegðun rakti áhrifin til serótónínvirkrar grunnvirkni, í samræmi við þekkta hömlun litarefnisins á mónóamínoxídasa. Mest lýsandi var að fósturvísaæti sem innihélt metýlenblátt huldi væntanlega breytingu á hreyfivirkni við SSRI-efnið flúoxetín. Skimunarpróf sem er framkvæmt í bláu vatni getur því misst af áhrifum efnis sem tært vatn myndi sýna.

Hér er engin raunveruleg mótsögn. Efnasamband getur skilið eftir sig engin greinanleg áhrif tveimur dögum eftir útskolun í einu prófi og samt verið virkt meðan það er til staðar í öðru. Hagnýta túlkunin er sú að niðurstaðan sem sýndi engin áhrif styðji efri styrkmörk, ekki fullyrðingu um hlutleysi, en niðurstaðan sem sýndi áhrif lýsi áhættunni sem skiptir máli: virkri útsetningu meðan mælingar fara fram, við nákvæmlega þær aðstæður sem flestar rannsóknarstofur nota.

Oxunar- og afoxunarlitarefni í oxunar- og afoxunarprófi

Ein gildra enn á skilið sérstaka málsgrein því hún skekkir mælinguna fremur en að hafa áhrif á dýrið. Orkunotkunarprófið Alamar Blue byggist sjálft á oxunar- og afoxunarefnahvörfum: resazúrín afoxast í flúrljómandi resórúfín. Metýlenblátt tekur einnig þátt í oxunar- og afoxunarefnahvörfum. Í frumulausum viðmiðum drógu báðir umhirðustyrkirnir lítillega en marktækt úr flúrljómun Alamar Blue eftir 24 klukkustundir. Í dýratilraununum voru útsettir fósturvísar þvegnir að minnsta kosti þrisvar í litarefnislausu æti fyrir prófið og líffræðilegu áhrifin í klöktum lirfum voru meiri en truflunin í frumulausu viðmiðunum. Hvort tveggja er því rétt: þvegin dýr sýna raunveruleg efnaskiptaáhrif og óþvegið litarefni bætir beinni efnafræðilegri mæliskekkju þar ofan á. Viðmið verða að aðgreina þetta tvennt, annars hefur hvorug talan merkingu. Almennar leiðbeiningar um túlkun niðurstaðna úr prófum sem byggjast á litarefnum eiga hér sérstaklega vel við.

Tímalína þroskastiga

Frumsamið yfirlit fyrir þessa grein. Styrkurinn er við hefðbundnu umhirðugildin tvö, 0.00005% og 0.0001%, nema annað sé tekið fram.

Mynstrið sem ber að muna er aukning í mælibreytum efnaskipta snemma og minnkun síðar, með hegðunaráhrifum meðan útsetning stendur yfir sem voru ekki greinanleg eftir úthreinsun í eina prófinu sem kannaði það.

Gátlisti fyrir hönnun viðmiða

Annað frumsamið yfirlit. Notaðu það þegar verklag fyrir sebrafiska með metýlenbláu skarast við tilraun.

1. Skráðu litarefnið sem hvarfefni, ekki sem vatn. Tilgreindu styrk bæði í prósentum og micromolar, upphaf og lok í klukkustundum eða dögum eftir frjóvgun, áætlun um endurnýjun og útskolunartíma fyrir hverja mælingu.
2. Láttu viðmið svara rannsóknarspurningunni. Rannsókn á prófunarefninu þarf litarefnislaus viðmið; rannsókn á umhirðu þarf litarefnislausa hópa og hópa með litarefni, þar sem árangur gegn sveppum er skráður, enda mældi hvorug tilvitnuð rannsókn virkni gegn sveppum.
3. Þvoðu fyrir oxunar- og afoxunarpróf og sannreyndu síðan. Skolaðu að minnsta kosti þrisvar í litarefnislausu æti og keyrðu samhliða frumulaust viðmið með litarefni og hvarfefni, því litarefnið dregur beint úr mælisvari Alamar Blue.
4. Líttu á mælibreytur hegðunar og mónóamína sem sérstaklega viðkvæmar fyrir truflun. Rannsóknir á hreyfivirkni, fælniviðbrögðum, kvíðalíkri hegðun, þunglyndislyfjum og MAO-hemlum ættu að forðast litarefnið meðan mælt er eða sýna fram á hlutleysi gagnvart viðkomandi mælibreytu; útskolun í einn til tvo daga fjarlægði ein áhrif á hreyfivirkni en það hefur ekki verið staðfest fyrir aðrar tilraunauppsetningar.
5. Líttu á mælibreytur efnaskipta og hvatbera sem sérstaklega viðkvæmar fyrir truflun á öllum þroskastigum. Súrefnisnotkun, orkunotkun, himnuspenna og umrit öndunarkeðjunnar breytast við umhirðustyrk, í gagnstæðar áttir fyrir og eftir klak.
6. Ekki yfirfæra hlutleysi milli tilraunauppsetninga. Niðurstaða sem sýnir engin áhrif eftir útskolun nær ekki til áframhaldandi útsetningar; niðurstaða sem sýnir engin áhrif á formgerð nær ekki til efnaskipta eða víxlverkunar við lyf; niðurstaða við einn stofn, eitt hitastig eða eina próflengd nær ekki til annarra.
7. Tilgreindu leiðbeiningarnar sem þú fylgdir og aðra möguleika. Nefndu sérstaklega styrk samkvæmt CCAC, evrópskum leiðbeiningum eða Cold Spring Harbor og bentu á hvar fósturvísapróf OECD sleppir litarefninu, svo lesandinn geti sett aðstæður dýranna þinna í samhengi.

Ekkert af þessu mælir gegn því að nota litarefnið til að halda hrognum lifandi. Það mælir gegn því að ákvörðun um umhirðu berist óathuguð inn í gögnin. Blái liturinn í skálinni stafar af sameind með lyfjafræðilega virkni og tilraunirnar sem eru líklegastar til að skekkjast eru einmitt afkastamiklar skimanir á efnaskiptum og taugahegðun, þar sem ungir sebrafiskar eru nú gjarnan fyrsta val. Skráðu það, notaðu viðmið fyrir það, skolaðu það út áður en þú mælir og athugaðu mæliprófið sem það gæti tekið þátt í án þess að eftir því sé tekið.