Metýlenblátt í G6PD-rannsóknarstofuprófum: hvert er raunverulegt hlutverk litarefnisins?

Nemandi skoðar tvö tilraunaglös eftir hitun. Annað hefur fengið þann lit sem búist var við. Hitt hefur ekki gert það. Nemandinn ályktar að síðari sjúklingurinn sé með skort á glúkósa-6-fosfatdehýdrógenasa. Sú niðurstaða kann að vera rétt, en röksemdafærslan sleppir hugmyndinni sem prófið byggist á. Ekkert í glasinu mælir ensímið beint. Prófið mælir það sem ensímið framleiðir og notar metýlenblátt sem millilið.

Þegar þessi óbeina mæling er orðin skýr virðast framkvæmdin, viðmiðin og langi listinn yfir rangar niðurstöður ekki lengur tilviljanakennd.

Stutta svarið

Metýlenblátt í G6PD-prófum er oxunar-afoxunarvísir. Ensímið G6PD myndar NADPH og NADPH-háð kerfi afoxa blátt metýlenblátt yfir í litlaust leúkóform þess eða nota það til að flytja rafeindir. Eðlileg ensímvirkni leiðir til skilvirkrar afoxunar. Skert virkni leiðir til hægrar eða ófullkominnar afoxunar. Þetta er allt mælisvarið.

Tvær sögulegar aðferðir nota sama litarefni en hafa ólíka endapunkta. Ef þeim er haldið aðgreindum hverfur mestur misskilningur.

Tvö próf, eitt litarefni, ólíkir endapunktar

Fyrra prófið er beint afoxunarpróf með metýlenbláu, sem Sass og samstarfsfólk lýstu og Gibbs mat síðar. Hér er endapunkturinn litarefnið sjálft: oxað, blátt metýlenblátt afoxast í átt að litlausu leúkómetýlenbláu og hraði þeirrar breytingar endurspeglar getu til að mynda NADPH. Upprunalega skimunargreinin er skráð á PubMed undir Sass o.fl. (1966).

Síðara prófið er methemóglóbín-afoxunarpróf Brewers. Natríumnítrít oxar fyrst hemóglóbín yfir í brúnt methemóglóbín. Metýlenblátt virkar síðan sem milliliður við rafeindaflutning: afoxað metýlenblátt flytur afoxunarígildi til methemóglóbíns og breytir því aftur í rautt hemóglóbín. Sýnilegi endapunkturinn er því brúnn litur á móti rauðum, ekki blár á móti litlausum. Upprunalega aðferðin birtist í Bulletin of the World Health Organization (Brewer o.fl., 1960).

Það er efnafræðilega ónákvæmt að kalla Brewer-prófið próf á aflitun litarefnis. Litarefnið fer í gegnum hringrás; hemóglóbínið breytir um lit. Skýringarmyndin hér að neðan sýnir báðar leiðirnar.

Efnahvarfið sem liggur að baki

G6PD hvatar fyrsta oxunarþrep pentósafosfatferilsins:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Þroskuð rauð blóðkorn reiða sig að miklu leyti á þennan feril til að fá NADPH, eins og fjallað er um í yfirlitsgrein Luzzatto og samstarfsfólks í Blood (2020). NADPH heldur glútatíóni afoxuðu og verndar frumuna gegn oxunarskemmdum. Metýlenblátt kemur inn í þetta kerfi sem rafeindaþegi. Nægilegt G6PD gefur nægilegt NADPH, sem leiðir til skilvirkrar afoxunar. Lítið G6PD rýfur keðjuna við fyrsta hlekkinn.

Hugsaðu um litarefnið sem eldsneytismæli, ekki vélina sjálfa. Það gefur upplýsingar um framboð NADPH. Allt annað sem breytir því framboði eða aflestrinum getur hreyft vísinn án þess að nein breyting hafi orðið á geninu.

Hvernig próf af Brewer-gerð er framkvæmt

Samsetning hvarfefna hefur verið breytileg í gegnum áratugina og því má ekki rugla kennslulýsingu saman við verklýsingu fyrir klínískar rannsóknir. Hver rannsóknarstofa fylgir eigin gildu staðlaðri verklýsingu. Með þann fyrirvara er hefðbundna glasaðferðin framkvæmd á eftirfarandi hátt, eins og lýst er með þremur glösum og 3 klukkustunda hitun í þessari birtu útfærslu:

1. Sjúklingsglas: heilblóð ásamt glúkósa, natríumnítríti og metýlenbláu. Nítrít myndar methemóglóbín, glúkósi sér efnaskiptum rauðra blóðkorna fyrir næringu og litarefnið miðlar NADPH-háðum rafeindaflutningi.
2. Oxað viðmið: blóð ásamt nítríti og glúkósa en engu metýlenbláu. Það sýnir brúna methemóglóbín-endapunktinn, mynstrið sem einkennir skort.
3. Hemóglóbínviðmið: blóð ásamt vatni. Það sýnir rauða hemóglóbín-endapunktinn, eðlilega mynstrið.
4. Hitið öll glösin við um 37 C, yfirleitt í 3 klukkustundir, og blandið varlega.
5. Þynnið lítinn skammt úr hverju glasi með eimuðu vatni til að rjúfa frumurnar og gera litasamanburðinn læsilegan.
6. Berið saman sjúklingsglasið og viðmiðin tvö. Breyting aftur í átt að rauðu bendir til umtalsverðrar afoxunargetu. Viðvarandi brúnn litur bendir til verulegs skorts.

Í einni eldri samsetningu var notað um 1 mL af blóði með hvarfefnum þar sem styrkur natríumnítríts var um 180 mM, dextrósa 280 mM og metýlenblás 0.4 mM. Líta skal á þessar tölur sem dæmi úr birtum heimildum, ekki sem algilda forskrift.

Lestur niðurstöðunnar

Eigindleg skimun greinir best á milli niðurstaðna í kringum 30 til 40 prósent af eðlilegri virkni, eins og fjallað er um í þessari yfirlitsgrein í Malaria Journal um gloppur í greiningu G6PD-skorts. Eðlileg skimunarniðurstaða merkir því að prófið greindi ekki alvarlegan skort. Hún staðfestir ekki að virknin sé að fullu eðlileg.

Hvers vegna skimun getur verið villandi

Fjölgun netfrumna eftir blóðrof er klassísk ástæða falskrar eðlilegrar niðurstöðu. Ung rauð blóðkorn og netfrumur innihalda meira G6PD en eldri frumur. Við brátt blóðrof geta elstu frumurnar, sem hafa mestan skort, þegar verið eyðilagðar og skilið eftir ungan frumuhóp sem mælist með eðlilega virkni. Þetta sama líffræðilega ferli getur einnig villt um fyrir magnbundnum prófum, ekki aðeins skimunarprófum með litarefni.

Nýleg blóðgjöf felur skort vegna þess að rauð blóðkorn gjafans leggja til sitt eigið ensím í sýnið. Mayo Clinic Laboratories nefnir blóðgjöf meðal ástæðna fyrir óáreiðanlegum ensímniðurstöðum, ásamt fjölgun netfrumna og truflun af völdum hvítra blóðkorna.

Arfblendnar konur eru erfiðasti hópurinn. Tilviljanakennd óvirkjun X-litnings veldur blöndu af eðlilegum rauðum blóðkornum og blóðkornum með skort, og heildarvirknin getur verið allt frá verulega skertri til að því er virðist eðlilegrar. Eigindleg skimunarpróf missa oft af millistigssvipgerðum. Í gögnum WHO um G6PD-prófanir er fjallað ítarlega um þessa takmörkun.

Aldur sýnis, geymsluhitastig, huglæg sjónræn ákvörðun endapunkts, blóðkornahlutfall og gæði hvarfefna bæta við mæliþáttum sem valda óvissu, ofan á þessi líffræðilegu áhrif.

Skimun er ekki greining

Skimunarniðurstaða sem bendir til skorts, sýnir millistig eða samræmist ekki klínísku mati kallar á magngreiningu á G6PD-ensímvirkni. WHO lítur á magnbundna litrófsmælingu við stýrt hitastig sem viðmiðunaraðferð. Í því prófi er glúkósa-6-fosfati og NADP+ bætt við sýni úr rofnum rauðum blóðkornum og fylgst með myndun NADPH með aukinni gleypni við 340 nm. Breytingarhraðinn er í réttu hlutfalli við ensímvirkni, yfirleitt staðlað miðað við hemóglóbín og gefið upp sem einingar á gramm. Núverandi starfsháttum klínískra rannsóknarstofa er lýst í færslu prófaskrár Mayo um G6PD-virkni.

Við túlkun er notað viðmiðunarsvið sem rannsóknarstofan hefur sannprófað, oft sett fram miðað við eðlilega virkni í þýðinu. Algengt er að fjalla um skort í kringum 30 prósenta mörkin og millistigsvirkni þar fyrir ofan. Marklýsingar WHO fyrir G6PD-próf (2022) setja fram þennan greiningarramma. Ef nýlegt blóðrof eða blóðgjöf gerir ákvörðun svipgerðar óáreiðanlega skal endurtaka prófið eftir að samsetning rauðu blóðkornanna hefur náð jafnvægi á ný. Sameindapróf geta þá veitt viðbótarupplýsingar án þess að koma í stað ensímmælingarinnar.

Mikilvæg aðgreining

Metýlenblátt í þessum prófum er ex vivo rannsóknarstofuhvarfefni. Það er annað umræðuefni en öryggi þess að gefa sjúklingi metýlenblátt, sem fjallað er um í leiðbeiningum um frábendingar fyrir metýlenblátt. Lífefnafræðin tengir þetta tvennt, þar sem lyfið er einnig háð NADPH-háðri afoxun, en litarefni í tilraunaglasi er ekki skammtur í blóðrás. Til að fá samhengi um hvernig litarefnið virkar sem litunarefni við aðrar aðstæður má skoða meginreglur litunar með metýlenbláu. Um þann efnaflokk sem það tilheyrir má lesa um oxunar-afoxunarlitarefni á rannsóknarstofum.

Skimun spyr hvort afoxunargetan virðist óskert. Staðfesting spyr hversu mikið ensím sé raunverulega til staðar. Litarefnið þjónar fyrri spurningunni vel, svo lengi sem enginn ætlast til þess að það svari þeirri síðari.