Gerpróf með metýlenbláu: talning lifandi frumna eða tímamæling á öndun

Tvö tilraunaglös standa á vinnubekknum. Bæði eru blá. Í öðru þeirra merkja bláar frumur í smásjánni að gerið sé dautt. Í hinu merkir breyting úr bláu í litlaust að gerið sé lifandi og andi. Sama litarefni, gagnstæð túlkun. Ef prófunum tveimur er ruglað saman snúast allar ályktanir við.

Þessi grein snýst um þennan greinarmun. Metýlenblátt er oxunar- og afoxunarlitarefni: oxað er það blátt, en afoxað er það litlaust leúkómetýlenblátt. Lífvænleikatalning nýtir þessa efnafræði í stuttri smásjárskoðun. Öndunartilraun nýtir hana í tímamældu efnahvarfi í sýninu í heild. Hvort próf þarf eigið verklag, eigin viðmið og eigin gagnrýna nálgun.

Lífvænleikatalning: stutt litun, tafarlaus skoðun

Verklagið sem notað er í brugghúsum er staðlaðasta útgáfan. Útbúið 0.01% w/v metýlenblátt í 2% natríumsítrati, blandið því 1:1 við gerfrumusviflausnina og skoðið blönduna eftir stuttan, fyrirfram ákveðinn tíma. Birtir litunartímar eru frá 1 til 2 mínútum í handbók Brewing Science Institute upp í um 5 mínútur í rannsóknaraðferðum, en örverufræðiaðferð OIV fyrir vín krefst skoðunar innan 10 mínútna. Styrkur litarefnisins í talningarblöndunni verður um 0.005%. Setjið sýnið í endurbætt Neubauer-talningarhólf og flokkið dökkbláar frumur sem ólífvænlegar og ólitaðar frumur sem lífvænlegar við um 400x stækkun. Ljósbláar frumur eru taldar lifandi samkvæmt OIV-aðferðinni, sem bendir þegar til vandans við huglægt mat sem fjallað er um hér að neðan.

Styrkur frumna er reiknaður út frá rúmfræði talningarhólfsins. Þegar allur miðferningurinn, með 1 mm hliðarlengd, er talinn jafngildir fjöldi frumna í mL N sinnum þynningarstuðullinn sinnum 10^4, þar sem N er fjöldinn á því svæði, eins og fram kemur í geraðferðum ASBC. Lífvænleiki er einfaldari: fjöldi ólitaðra frumna deilt með heildarfjölda frumna, sinnum 100. Teljið um 400 frumur til að meta lífvænleika, í samræmi við samanburðarrannsókn FEMS á brugghúsum og verklag OIV. Fylgið alltaf sömu reglu um frumur á jaðarlínum, til dæmis með því að telja frumur á neðri og vinstri línum reitsins en sleppa þeim á efri og hægri línum.

Ákveða þarf reglu um knappa áður en talning hefst. Algeng venja er að telja knapp sem sérstaka frumu þegar hann er orðinn um helmingi stærri en móðurfruman, en annars með móðurfrumunni. Hvaða regla sem er valin skal henni beitt í öllum reitum og hún skráð á talningarblaðið svo næsti aðili geti fylgt henni.

Talningarblað (prentið þetta)

Þetta talningarblað var sérstaklega útbúið fyrir þessa grein. Afritið það í vinnubók eða prentið eitt fyrir hvert sýni.

Lífvænleiki (%) = 100 x ólitaðar / (ólitaðar + dökkbláar). Heildarfjöldi frumna í mL = N x þynningarstuðull x 10^4, þar sem N er fjöldinn á skilgreindu svæði talningarhólfsins. Skráið litunartímann við hlið niðurstöðunnar, því lífvænleikagildi án tímasetningar er ekki endurtakanlegt.

Hvers vegna lífvænleikagildi breytast

Tímasetning er fyrsta truflunin og áhrif hennar geta verið í báðar áttir. Frumur með virk efnaskipti afoxa litarefnið, þannig að of snemmbúin skoðun getur sýnt lifandi frumur áður en þær hafa lokið afoxun þess og leitt til þess að þær séu ranglega flokkaðar sem dauðar. Langvarandi útsetning er hins vegar sjálf eitruð og veldur raunverulegum skemmdum á frumum sem verða bláar, svo litunin gefur ranga vísbendingu um frumudauða. Því kveður kennsluverklag fyrir rannsóknarstofur á um að meta frumurnar innan 5 mínútna, eins og lýst er í kennsluverklagi um ger frá Wisconsin. Rétt er að orða það svo að mat með metýlenbláu sé tímaháð. Veljið því einn stuttan litunartíma og haldið honum föstum fyrir öll sýni í sömu röð.

Sýni með lítinn lífvænleika fela í sér aðra skekkju. Staðlaða aðferðin varar við því að metýlenblátt geti ofmetið raunverulegan lífvænleika þegar hann er undir um 80%, því frumur sem enn afoxa litarefnið hafa ekki endilega haldið fjölgunargetu sinni. Bruggbókmenntir lýsa sama óáreiðanleika þegar lífvænleiki hefur minnkað verulega. Lítið á metýlenblátt sem fljótlegt gróft mat og staðfestið mikilvægar ákvarðanir við lítinn lífvænleika, svo sem um endurnotkun gerræktar í bruggun, með talningu eftir ræktun á skálum eða annarri litun til viðbótar.

Áhrif sýnisumhverfis koma í þriðja sæti. OIV-aðferðin er framkvæmd nálægt pH 4.6 og varar við því að sýni með lágt pH og mikla stuðpúðagetu komi í veg fyrir rétta hegðun litarefnisins. Hún mælir einnig gegn prófinu þegar sykurstyrkur er yfir 100 g/L, þar sem frumur sýnast villandi ljósbláar. Í tilraun þar sem pH við litun var borið saman breyttist næmnin verulega á því bili sem prófað var, í samræmi við rannsókn á pH-háðri aðferð með metýlenbláu. Agnir eru sérstök gildra: litaðar agnir í óhreinu meski líkjast dauðum frumum og auka breytileika milli þeirra sem telja.

Þessi breytileiki hefur verið mældur, ekki aðeins lýst með dæmisögum. Í sex mánaða brugghúsatilraun sem greint var frá í gersamanburði FEMS var meðalstaðalfrávik tvítekinna mælinga með metýlenbláu 6.1%, samanborið við 0.2% fyrir flæðifrumugreiningu með oxónóli. Niðurstöður tveggja aðila gátu munað allt að 13 prósentustigum fyrir sama sýni. Í megindlegum samanburði á lífvænleikaaðferðum frá 2023 reyndust flúrljómunarsmásjárskoðun og flæðifrumugreining mun nákvæmari, en jafnframt kom fram að frammistaðan ræðst af tegund og sýnisumhverfi. Hin sígilda aðferðarlýsing Painting og Kirsop (PMID 24430080) er áfram helsta viðmiðið, og víðtækari yfirlitsgrein um próf á lífvænleika og lífsþrótti gers (PMID 25154541) flokkar metýlenblátt með viðbótarprófum fremur en prófum sem gefa endanlega niðurstöðu. Trýpanblátt er ekki sjálfkrafa betri kostur hér: það gefur til kynna að frumuhimnan hafi misst heilleika sinn, en metýlenblátt sýnir bæði upptöku og afoxunarvirkni. Frumur undir álagi geta því flokkast á ólíkan hátt með þessum tveimur litarefnum.

Öndunartilraunin: mælið tímann þar til blái liturinn hverfur

Í seinna prófinu er aldrei horft í smásjá. Ger, glúkósi og þynnt metýlenblátt fara í lokað tilraunaglas og klukka mælir hversu langan tíma tekur fyrir bláa litinn að hverfa. Við efnaskipti mynda frumurnar afoxunarígildi sem umbreyta bláa litarefninu í litlaust form, en uppleyst súrefni oxar það aftur. Þegar frumurnar hafa gengið á súrefnið verður afoxun meiri en oxun og glasið aflitast. Endapunkturinn endurspeglar því jafnvægið milli öndunar, styrks litarefnis og súrefnisframboðs. Niðurstöðuna ætti að skrá sem afoxunar- eða aflitunartíma metýlenblás, ekki sem beinan hraða eyðslu sameindasúrefnis.

Notið mun þynnra litarefni en við lífvænleikamat svo tímamælingin falli á hentugt bil. Handbók AQA um skyldulegar verklegar æfingar á A level staðlar þetta vel: 1 g af glúkósa í 100 mL af vatni sem er hitað í um 30 C, 5 g af þurrgeri bætt við rétt fyrir notkun og vinnulausn litarefnis nálægt 0.001%, útbúin með því að þynna 0.1 mL af 1% stofnlausn upp í 100 mL. Blandið 2 mL af ger- og glúkósasviflausn við 2 mL af vinnulausn litarefnis, látið ná prófunarhitastiginu, hristið einu sinni í 10 sekúndur, setjið tímamælinguna af stað og hristið ekki aftur. Hristingur kemur súrefni aftur inn í blönduna og gerir glasið blátt á ný. Þetta er stærsta skekkjuvaldið í framkvæmdinni. AQA bendir á að blandan ætti venjulega að aflitast innan um 5 mínútna við 35 C, með meðaltímum úr tilraunum upp á 275 s við 20 C, 128 s við 35 C og 145 s við 45 C. Þetta eru dæmi úr einni tilraunauppsetningu, ekki algild viðmið. Sérhæfðar afoxunarrannsóknir styðja megindleg tengsl milli afoxunarhraða og gers með virk efnaskipti við stýrðar aðstæður, meðal annars rannsókn sem er skráð sem PMID 25773544 og rannsókn á verkunarferlinu í Yeast (2014).

Dæmi um tímaferil (sérstaklega útbúið efni)

Taflan hér að neðan er dæmi sem var sérstaklega útbúið fyrir þessa grein með uppsetningu í anda AQA, eins og lýst er hér að ofan: 2 mL af ger- og glúkósablöndu ásamt 2 mL af vinnulausn litarefnis nálægt 0.001%, hrist einu sinni í 10 sekúndur og síðan látin standa óhreyfð við prófunarhitastigið. Færslurnar eru dæmi um mæligildi á því sniði sem nemendahópur ætti að skrá. Hraðastuðullinn er skilgreindur sem 1 deilt með aflitunartíma í sekúndum. Framkvæmið tilraunina með sömu glösum og skiptið þessum færslum út fyrir mæld gildi.

Teiknið hraðastuðulinn sem fall af hitastigi fyrir glös A, B og C. Ferillinn hækkar og flatar síðan út eða lækkar. Það er væntanlegt mynstur fyrir ensímstýrt ferli, ekki bein lína. Glös D, E og F eru ekki gagnapunktar á þeim ferli. Þau eru viðmiðin sem gera kleift að túlka hann.

Viðmið sem gefa hvoru prófi merkingu

Hver öndunartilraun þarf þrjú viðmiðunarsýni. Soðið eða drepið ger ásamt glúkósa og litarefni ætti að haldast blátt og þannig sýna að hröð afoxun sé háð efnaskiptum lifandi frumna. Lifandi ger ásamt litarefni án viðbætts glúkósa er viðmið fyrir hvarfefnið, en búast má við hægri aflitun engu að síður þar sem gerið nýtir eigin forða. Glúkósi ásamt litarefni án gers er efnafræðilega blanksýnið. Það er nauðsynlegt vegna þess að glúkósi í basísku umhverfi getur afoxað metýlenblátt án þess að nokkrar frumur séu til staðar.

Lífvænleikatalning þarf annars konar viðmið: samræmi í framkvæmd. Sama stofnlausn litarefnis, sama blöndunarhlutfall, sami litunartími, sama svæði talningarhólfsins, sömu reglur um knappa og jaðarlínur, og blind talning þar sem því verður við komið. Þegar niðurstöður tveggja aðila munar tíu prósentustigum leiðir talningarblaðið yfirleitt í ljós orsökina: mismunandi tímasetningu, ólíkan þröskuld fyrir bláan lit eða ólíkar reglur um knappa. Aðferðir við undirbúning og skoðun litaðra frumna tengjast einföldum aðferðum við bakteríulitun, en víðtækara yfirlit yfir það sem litarefnið merkir í mismunandi sýnum er í myndasafni um litun fyrir smásjárskoðun. Um eðlisfræðina að baki megindlegri túlkun á styrk blás litar útskýra viðmiðunargögn um gleypni, merkt með mæliaðstæðum, hvers vegna hver stuðull verður að fylgja upplýsingum um leysi, pH og styrk við mælinguna.

Veljið prófið eftir spurningunni. Hversu margar frumur eru lifandi núna er talningarspurning sem er svarað við smásjána með talningarblaði. Hversu virk öndun þessarar ræktar er, er spurning um hraða ferlis sem er svarað með skeiðklukku og tilraunaglösum við stýrðar aðstæður. Metýlenblátt hentar í hvort tveggja, en aldrei í sama glasi á sama tíma.