Metýlenblátt til litunar á DNA og RNA: notkun í geljum og á himnum

Nemandi keyrir agarósagel, litar það með metýlenbláu og sér ekkert þar sem hann bjóst við greinilegu bandi. Á næsta vinnusvæði litar nýdoktor Northern-himnu úr sömu bláu flöskunni og fær skýr ríbósómabönd á þremur mínútum. Nemandinn ályktar að gelkeyrslan hafi mistekist. Hún mistókst ekki. Verkefnin voru ólík og sama litarefni svarar þeim með mismunandi næmni, mismunandi bakgrunni og mismunandi reglum um næstu skref.

DNA-litun og RNA-litun með metýlenbláu byggjast á sömu efnafræði en þjóna ekki sama tilgangi. Í geli sýnir litarefnið hversu mikil kjarnsýra er inni í gljúpu neti. Á himnu sýnir það hvort flutningurinn tókst og hvort sambærilegt magn var sett í brautirnar. Þegar þessi munur er skýr falla aðferðirnar, greiningarmörkin og samhæfismörkin í rétt samhengi.

Stutta svarið

Metýlenblátt er flatt, katjónískt litarefni sem binst kjarnsýrum án samgildra tengja og á afturkræfan hátt, með samspili rafstöðuaðdráttar að fosfati, innskots milli basapara og tengingar við minni skoruna. Þessi afturkræfni er einmitt lykilatriðið. Hægt er að lita bönd, skoða þau í sýnilegu ljósi og skrá þau, og síðan aflita þau eða hreinsa fyrir klónun, þáttapörun eða endurtekna þreifarakönnun.

Við litun tvíþátta DNA í agarósageli með metýlenbláu er hefðbundna hraðuppskriftin 0.02 prósent w/v (200 míkrógrömm á mL) í vatni, um 15 mínútna litun og síðan um 15 mínútna aflitun í vatni, með skoðun á ljósaborði með hvítu ljósi. Fyrir himnur er sígilda uppskriftin fyrir Northern-þrykk 0.02 til 0.04 prósent litarefni í natríumasetati við pH nálægt 5.2, nokkurra mínútna litun eftir flutning og festingu, síðan skolun með vatni og full aflitun fyrir þáttapörun. Næmnin er hófleg: tugir til hundruð nanógramma í hverju gelbandi við góðar aðstæður, en varfærnar leiðbeiningar nefna 0.5 til 1 míkrógramm. Það er mörgum stærðargráðum meira en fyrir etidíumbrómíð og SYBR-litarefni. Á himnum er ekkert eitt gagnlegt greiningarmark fyrir einstaka umritunarafurð, þar sem litunin sýnir aðallega ríbósóma-RNA sem er til staðar í miklu magni og heildarmagn sýnisins sem var sett á. Ekki nota fæðubótarlausn úr smásölu í stað litarefnisins í annarri hvorri uppskriftinni. Sannreyndar aðferðir gera ráð fyrir litarefni af greiningargæðum, skilgreindum stuðpúðum og meðhöndlun án RNasa þegar unnið er með RNA.

Hvernig bindingin virkar og hvar hún getur villt um fyrir

Gagnlega líkanið skiptist í þrjá hluta. Í fyrsta lagi dregst jákvætt hlaðna hringjakerfið að neikvætt hlaðinni fosfatgrindinni. Litrófsrannsóknir sýna að þessi rafstöðuþáttur er ráðandi við lágan saltstyrk, en líkanagerð og sameindahermun sýna að innskot og binding við minni skoruna eru stöðugar bindileiðir fyrir tvíþátta DNA, eins og tekið er saman í litrófsrannsókn á bindingu metýlenblás við DNA. Í öðru lagi er til staðar nokkur tilhneiging til að bindast GC fremur en öðrum röðum. Líkanagerð bendir til að CpG- og GpC-skref séu hagstæðari, og tilraunir sýna meiri tengingu við GC-ríka tvíþætti í rannsóknum á innskotsvali metýlenblás, en AT-tvíþættir bindast líka. Venjuleg litun er ekki sértæk fyrir basaröð. Í þriðja lagi bindast einþátta DNA og RNA aðallega með rafstöðukröftum og stöflun við aðgengilega basa og tvíþátta svæði. Þess vegna er styrkur litunar háður lengd, basaröð og annars stigs byggingu.

Af þessu leiðir tvennt. Þar sem bindingin er ekki samgild skolast litarefnið út. Bönd í pólýakrýlamíði dofna hratt nema þau séu sérstaklega fest, og sérstök útgáfa með varanlegri festingu er til einmitt vegna þess að venjuleg litun er tímabundin, eins og Soto og Draper lýsa fyrir PAGE-gel. Þar sem litarefnið er ljósnæmir getur löng og sterk lýsing á lituðu DNA í nærveru súrefnis oxað gúanín og að lokum rofið annan þáttinn. Þessu ferli er lýst í rannsóknum á gúanínoxun af völdum ljósnæmingar með metýlenbláu. Stutt skoðun í hvítu ljósi kemur í veg fyrir vel þekktar útfjólubláar skemmdir úr hefðbundnum verkferlum með etidíumbrómíði, og það er raunverulegur kostur þegar DNA á að endurheimta til frekari vinnslu. Sýnilegt ljós er mildara, ekki skaðlaust. Hafðu lýsingartímann stuttan þegar klóna á DNA. Nánari umfjöllun um ljósefnafræðina að baki þessari varúð er í ljósefnafræði metýlenblás og ferlunum tveimur. Um oxunar- og afoxunarparið og hleðsluástandið sem útskýra hvers vegna oxaða formið binst en afoxaða formið ekki, sjá efnafræði byggingar og eiginleika metýlenblás.

Verkefni eitt: litun inni í geljum

Gellitun svarar einni spurningu: er næg kjarnsýra í þessu bandi til að það sjáist með berum augum? Tvíþátta DNA í agarósa er best rannsakaða tilvikið. Upprunalega gellitunaraðferð Flores og samstarfsfólks með metýlenbláu staðfesti 0.02 prósent hraðaðferðina á 1 prósent agarósa og sýndi fram á árangursríka endurheimt og klónun á eftir. Sömu leiðbeiningar frá birgja má finna á vörusíðu IBI Scientific fyrir metýlenblátt, þar sem 0.04 prósent uppskriftin fyrir himnur og hraða gelútgáfan eru sýndar hlið við hlið.

Verkferill í framkvæmd:

1. Keyrðu gelið með venjulegum hætti. Litaðu eftir rafdrátt, ekki meðan á honum stendur, nema flutningur eða aðgreining hafi verið sannreynd fyrir breytta aðferð.
2. Dýfðu því í 0.02 prósent w/v metýlenblátt í eimuðu vatni og hreyfðu það varlega í um 15 mínútur.
3. Aflitaðu með nokkrum vatnsskiptum, samtals í um 15 mínútur, þar til bakgrunnslitur gelnetsins minnkar og böndin verða greinileg.
4. Taktu ljósmynd strax á ljósaborði með hvítu ljósi.

Agarósi og pólýakrýlamíð hegða sér ólíkt. Agarósi heldur litarefni í gelnetinu, svo aflitunin er hæga skrefið. Þunn pólýakrýlamíðgel litast hratt en missa líka litarefnið hratt. Það auðveldar að skera út bönd til frekari vinnslu en torveldar varðveislu niðurstaðna. Hægt er að staðsetja tilbúin fákirni í pólýakrýlamíði með sömu 0.02 prósent uppskrift á 20 til 30 mínútum með endurtekinni vatnsskolun, samkvæmt viðurkenndum PAGE-aðferðum af þeirri gerð sem birtist í Current Protocols. Lýst hefur verið mjög þynntum útgáfum, nálægt 0.0002 prósent í þynntu TBE, til að undirbúa fákirni til frekari vinnslu á nokkrum klukkustundum, en heimildagrunnurinn er veikari.

Það skiptir máli hvort um DNA eða RNA er að ræða. Tvíþátta DNA gefur sterkustu byggingarháðu bindinguna. RNA og einþátta DNA litast, en veikar og með síður fyrirsjáanlegum hætti. Fyrir RNA-gel úr agarósa með formaldehýði sleppa flestar rannsóknarstofur blárri litun í gelinu og flytja RNA fyrst yfir á himnu og lita það þar. Þannig fæst skýrara merki á himnu og skráning á sýnismagni í stað veikrar litunar í geli.

Verkefni tvö: litun á himnum

Himnulitun svarar annarri spurningu: tókst flutningurinn og eru brautirnar samanburðarhæfar? Sígilda notkunin er afturkræf litun Herrin og Schmidt á Northern-þrykki, upphaflega með 0.04 prósent litarefni í 50 mM natríumasetati við pH 5.0 í 2 til 3 mínútur, með vatnsskolun á eftir. Litarefnið má fjarlægja með þynntu SDS í SSPE fyrir þáttapörun.

Algeng nútímaútgáfa er framkvæmd þannig:

1. Flyttu RNA eða eðlissvipt DNA yfir á nælon eða nítrósellulósa og festu það síðan með útfjólublárri krosstengingu eða hitun svo sýnið tapist ekki við litun.
2. Valfrjálst en algengt: vættu himnuna í 5 prósent ediksýru í um 15 mínútur.
3. Litaðu í 5 til 10 mínútur í 0.02 til 0.04 prósent metýlenbláu í 0.3 til 0.5 M natríumasetati við pH nálægt 5.2.
4. Skolaðu og aflitaðu í vatni í 5 til 15 mínútur, skráðu niðurstöðuna og fjarlægðu síðan litarefnisleifar fyrir þáttapörun.

Jákvætt hlaðið nælon er langalgengast við Northern-vinnu. Nítrósellulósi virkar líka með sama verkferli með ediksýru og asetati. Myndin er notuð til að staðfesta flutning, bera saman 28S- og 18S-bönd (eða 23S og 16S fyrir bakteríu-RNA), merkja stærðarstiga og viðmið og halda grófa skrá til stöðlunar út frá heildar-RNA. Í birtum Northern-aðferðum eru lituð ríbósómabönd magngreind til að kanna sýnismagn í brautum, meðal annars í mjólkurvísindarannsókn sem notaði ríbósómabönd lituð með metýlenbláu til stöðlunar. Hægt er að gera Southern-himnur sýnilegar á sama hátt, en litarefnið er mun rótgrónara sem leið til að kanna sýnismagn og flutning í Northern-aðferðum. DNA í Southern-aðferðum er auk þess eðlissvipt fyrir flutning, svo næmnistölur fyrir gel eiga ekki við þar.

Greiningarmörk og bakgrunnur: hvar bláa litunin stendur höllum fæti

Samanburðurinn hér að neðan er vísvitandi grófur. Árangur litunar fer eftir styrk gelsins, bandbreidd, ljósbúnaði og því hversu vel aflitun er framkvæmd. Líttu á hverja tölu sem stærðargráðu, ekki tæknilega forskrift.

Stýring bakgrunns ræður því hvort hóflegt merkið er nothæft. Frjálst litarefni er mjög litsterkt, svo birtuskil fást með því að fjarlægja óbundið litarefni án þess að fjarlægja það bundna. Sterkari litunarlausn eykur sjaldan næmni. Hún lengir fyrst og fremst aflitunartímann. Keyrðu þynningarröð með nákvæmlega því geli, þeirri himnu og þeirri myndavél sem á að nota, og notaðu aðeins bilið þar sem heildaður ljósþéttleiki er í réttu hlutfalli við upphaflegt sýnismagn. Metýlenblátt hentar til hálfmagnbundinnar stöðlunar á sýnismagni. Það er ekki magngreiningaraðferð með vítt mælisvið, því burðargeta himnunnar, flutningsnýtni, mettun og aflitun eru mismunandi milli brauta.

Samhæfismörk: hvað þolir litunina

Sýnt hefur verið fram á klónun eftir bláa litun. Flores og samstarfsfólk skáru lituð bönd úr agarósageli, endurheimtu DNA, lígðu það og notuðu það til umbreytingar. Þau greindu frá betri klónun en eftir etidíumbrómíðlitun með útfjólubláu ljósi. Líkleg skýring er minni ljósskemmdir, ekki ávinningur af litarefninu sjálfu. Hafðu lýsingu með hvítu ljósi stutta og hreinsaðu endurheimt DNA með venjulegri gelútdráttaraðferð.

Gögn um PCR og raðgreiningu eru takmarkaðri. Litarefnisleifar bindast kjarnsýrum, svo aflitaðu og hreinsaðu fyrir ensímskref. Búast má við að rétt hreinsað DNA úr blálituðu geli virki, en þol mismunandi pólýmerasa og raðgreiningarefna fyrir litarefni sem berst með sýninu hefur ekki verið mælt vel. Ekki ganga út frá því.

Þáttapörun á þrykkhimnu er samhæf lituninni þegar röðinni er fylgt nákvæmlega: flutningur, festing, litun, skráning, aflitun, þáttapörun. Þessi röð er aðferð Herrin og Schmidt. Litun fyrir flutning, eða að sleppa aflitun, er önnur aðferð sem þarf að sannreyna sérstaklega. Þegar litarefnið hefur verið fjarlægt er hægt að fjarlægja þreifara og endurtaka þreifarakönnun með hefðbundnum hætti. Um litun frumna með sömu litarefnafjölskyldu og hvers vegna forsendur fyrir fest frumustrok eiga ekki við um aðferðir fyrir lifandi frumur, sjá yfirlit yfir smásjárlitun.

Útskurður banda virkar fyrir agarósa þegar undirbúa á sýni til frekari vinnslu og fyrir fákirni í PAGE sem hafa verið staðsett með blárri litun, að því gefnu að útgáfan með varanlegri festingu sé ekki notuð. Rafútskolun eftir aflitun er efnafræðilega trúverðug fyrir afturkræft bindiefni, en lítið er um gögn úr stýrðum tilraunum um heimtur sérstaklega með metýlenbláu. Fjarlægðu sölt eða felldu sýnið út eftir útskolun.

Vandamál sem endurtaka sig

Dauf gelbönd þýða yfirleitt að massinn er of lítill fyrir litmælingarlitun, sérstaklega þegar um er að ræða stutt einþátta sýni eða RNA. Settu meira sýni á gelið, notaðu ferska litunarlausn, lengdu litunartímann áður en styrkurinn er aukinn og hættu aflitun fyrr. Alblátt gel án birtuskila þýðir yfirleitt of mikla litun eða of fá vatnsskipti. Dofnun PAGE-banda er eðlileg efnafræðileg hegðun, ekki misheppnuð litun. Taktu ljósmynd fljótt. Ójafn bakgrunnur á himnu bendir til fellinga, loftbóla, fingrafara, ójafnrar hreyfingar eða ójafns flutnings. Ekki túlka það sem mismunandi sýnismagn án viðmiðunar úr þáttapörun. Óskýrt og veikt ríbósómamynstur getur þýtt niðurbrot, en líka ófullkominn flutning, of lítið heildar-RNA (venjulegar brautir innihalda frá nokkrum upp í tugi míkrógramma) eða of mikla aflitun. Litarefnið sýnir ríbósóma-RNA sem er til staðar í miklu magni. Það sýnir ekki tiltekna umritunarafurð. Það hlutverk er þreifarans.

Öryggi og meðhöndlun án ýktra fullyrðinga

Metýlenblátt er einfaldara í meðhöndlun en etidíumbrómíð, en það er ekki skaðlaust. Gildandi öryggisblað frá MilliporeSigma flokkar litarefnið í flokk 4 fyrir bráð eiturhrif við inntöku, skaðlegt við inntöku, og kveður á um förgun eftir viðurkenndri úrgangsleið samkvæmt öryggisblaði Sigma-Aldrich fyrir metýlenblátt. Etidíumbrómíði fylgja sterkari viðvaranir um eiturhrif á erfðaefni, meðal annars grunur um áhrif á kímfrumur í öryggisblaði Sigma-Aldrich fyrir etidíumbrómíð. Gel og lausnir sem innihalda það eru almennt aðskilin sem hættulegur efnaúrgangur, eins og fram kemur í leiðbeiningum Thermo Fisher um kjarnsýrulitarefni. Fylgdu öryggisblöðum og reglum stofnunarinnar fyrir bæði efnin. Geymdu þurrt litarefni þurrt í vel lokuðum umbúðum, endurnotaðu vinnulausn aðeins eins og aðferðin leyfir, geymdu litaðar himnur þurrar milli síublaða og ljósmyndaðu gel áður en böndin dreifast út.

Mundu meginregluna við vinnuborðið. Gel prófa sýnileika við mikið sýnismagn í hvítu ljósi. Himnur prófa flutning og sýnismagn áður en þreifarinn sinnir næmu greiningunni. Eitt litarefni þjónar báðum verkefnum, með hóflegri næmni, afturkræfri bindingu og ströngum kröfum um röð vinnsluskrefa.