Mæling á áhrifum metýlenblás á hvatbera: súrefni, ATP og himnuspenna

Segjum að rannsóknarstofa bæti metýlenbláu við hvatbera með skerta öndun og sjái súrefnisnotkun aukast. Eðlilegt væri að skrifa að litarefnið hafi endurheimt starfsemi hvatberanna. Sú setning gæti verið röng. Súrefnisflæði, ATP-myndun og himnuspenna eru þrjú aðskilin hugtök. Þau tengjast sama frumulíffæri rétt eins og öryggisafritun, samstilling og deiling tengjast sömu skýjamöppu: þau eru skyld en lúta ólíkum reglum. Ef einu er ruglað saman við annað stenst túlkunin ekki, jafnvel þótt hver mæling sé tæknilega rétt.

Metýlenblátt eykur líkurnar á þessum ruglingi vegna þess að það tekur þátt í kerfinu sem verið er að mæla. Það fer í gegnum endurteknar oxunar-afoxunarhringrásir, tekur við rafeindum fyrr í ferlinu og gefur þær frá sér síðar, er fitusækin katjón sem safnast upp í hvatberum með rafefnafræðilegan stigul og er sterkt blátt efnasamband sem gleypir og gefur frá sér ljós á sömu bylgjulengdarsviðum og algengir nemar. Ein mælistærð getur ekki fangað allt þetta. Áreiðanlega aðferðin, sem sést í hvatberarannsóknunum frá Búdapest, er að mæla súrefnisflæði ásamt hraða ATP-myndunar, himnuspennu og losun vetnisperoxíðs, með viðmiðunarprófunum sem taka sérstaklega mið af litarefninu í hverju skrefi.

Öndunarmælingar mæla súrefnisflæði, ekki orkuframleiðslu

Öndunarmælingar með mikilli upplausn, hvort sem notaður er Oroboros Oxygraph eða Seahorse-greiningartæki fyrir utanfrumuflæði, segja til um eitt: hversu hratt súrefni er afoxað. Þær segja ekki til um hversu mörgum róteindum var dælt fyrir hverja rafeind, hversu stór hluti stigulsins varðveittist eða hvort ATP-syntasi nýtti hann.

Orðavalið skiptir máli. Í einangruðum hvatberum gefur hvarfefni án ADP lekaöndun, hvarfefni með mettandi styrk ADP gefur getu til oxunarfosfórunar og títrun með aftengiefni gefur hámarksgetu rafeindaflutnings. Í heilum frumum eru samsvarandi Seahorse-mælistærðir grunnöndun, ólígómýsínnæm ATP-tengd öndun, róteindaleki, hámarksöndun skilgreind með FCCP og súrefnisnotkun utan hvatbera sem er ónæm fyrir rótenóni og antímýsíni. Að kalla niðurstöður Seahorse State 3 og State 4 gefur til kynna nákvæmni sem sýnagerðin styður ekki, eins og rammi Agilent Mito Stress Test skýrir.

Metýlenblátt rýfur þau tengsl sem virðast augljós milli meiri súrefnisnotkunar og meiri orku. Í einangruðum heilahvatberum úr naggrísum jók litarefnið við 100 nM til 1 uM súrefnisnotkun í hvíld með glútamati ásamt malati, súksínati og alfa-glýserófosfati sem hvarfefnum. Aukningin var um 64 prósent með alfa-glýserófosfati, en ADP-örvuð öndun í heilbrigðum hvatberum var að mestu óbreytt samkvæmt rannsókninni á einangruðum heilahvatberum. Þar sem lekaöndun jókst en ADP-örvað flæði stóð í stað lækkar reiknað öndunarstýrihlutfall. Sú lækkun þýðir ekki að litarefnið hafi skemmt hvatberana. Hún þýðir að litarefnið bætti súrefnisnotandi oxunar-afoxunarhringrás við venjulega öndun. Súrefnisnotkunarpróf með metýlenbláu sem greinir aðeins frá aukningunni hefur mælt raunverulegt efnaferli en segir ekkert um varðveislu orku.

Tilraunir til að endurheimta starfsemi sýna sama mun í stærra mæli. Þegar flétta I var hömluð jókst súrefnisflæði um þrefalt en ATP-myndun aðeins um 1.5-falt. Meira súrefni náði til rafskautsins. Minni hluti þess nýttist til ATP-myndunar. Sérhver fullyrðing um bætta oxunarfosfórun þarf að taka ATP-hliðina með í reikninginn, helst sem hlutfall ATP á hvert súrefni, með skýringu á því hvernig nefnarinn er skilgreindur.

ATP-próf mæla myndunarhraða, sem magn getur ekki komið í staðinn fyrir

ATP-próf svarar annarri spurningu: hversu mikið ATP myndast á tímaeiningu. Hraðamæling, annaðhvort með mælingu á ljóma frá lúsíferasa úr eldflugum yfir nokkrar mínútur eða með samtengdu hexókínasa- og glúkósa-6-fosfatdehýdrógenasaprófi sem er lesið við 340 nm, gefur hraða. Ein mæling á heildar-ATP við lokapunkt gefur magn, sem endurspeglar myndun að frádreginni notkun og segir eitt og sér lítið um oxunarfosfórun.

Hópurinn í Búdapest notaði samtengdu ensímaðferðina með adenýlatkínasa hamlaðan og komst að því að metýlenblátt við 1 til 2 uM jók ATP-framleiðslu lítillega en marktækt í hvatberum sem höfðu verið meðhöndlaðir með rótenóni og antímýsíni. Það er raunveruleg endurheimt, en aðeins að hluta. Rannsóknin á eiturverkunum TEGDMA fékk sams konar niðurstöðu í öðru líkani: 5 mM af tannaefniseinliðunni TEGDMA dró úr öndun tengdri fléttu I úr um 286 í 28 flæðieiningar og 2 uM af litarefninu jók hana aftur í um 86.

Tvær viðmiðunarprófanir eru ófrávíkjanlegar þegar unnið er með litað oxunar-afoxunarefnasamband. Í fyrsta lagi þarf að nota ólígómýsín til að ákvarða hversu stór hluti mældrar ATP-myndunar er háður ATP-syntasa. Í öðru lagi þarf að gera frumulaust endurheimtarpróf með þekktri ATP-viðbót, öllum prófhvarfefnunum og nákvæmlega þeim litarefnisstyrkjum sem notaðir eru, að lágmarki 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM. Litarefnið getur gleypt útgefið ljós, hamlað merkjaensíminu eða breytt oxunar-afoxunarefnafræði hvarfefnanna, og almennar leiðbeiningar um lúsíferasapróf mæla með lífefnafræðilegum mótprófunum einmitt vegna þessarar tegundar truflunar. Ekki gera ráð fyrir að 1 uM sé laust við mælingabjögun þótt ljósdeyfing sé yfirleitt meiri við hærri styrk.

Nemar fyrir himnuspennu mæla dreifingu litarefnis, ekki flæði

Safranín O, TMRM og TMRE, ród amín 123 og JC-1 eru allt katjónir sem komast í gegnum himnur. Þær safnast upp í neikvætt hlaðna innra rýminu samkvæmt rafefnafræðilegu jafnvægi, þannig að heildarflúrljómun gefur óbeint til kynna spennuna út frá því hvar neminn er staðsettur. Enginn þeirra mælir ATP eða rafeindaflæði.

Hver nemi hentar best tiltekinni sýnagerð. Safranín O hentar einangruðum hvatberum og frumum með gegndræpa frumuhimnu, yfirleitt við um 2 uM með örvun nálægt 495 nm og ljósútgeislun nálægt 585 nm. Það er notað við skilyrði þar sem ljósdeyfing á sér stað og upptaka breytir heildarflúrljómun. TMRM og TMRE henta heilum frumum við lágan nanómólar styrk án ljósdeyfingar; þá losnar litarefnið við afskautun og flúrljómun hvatbera minnkar. Við mikla hleðslu getur stefna merkisins snúist við vegna sjálfsdeyfingar. JC-1 gefur þægilegt hlutfall grænnar og rauðrar flúrljómunar en er háð hleðslu og hvatberamassa, sem gerir það síðri kost í magnbundnum mælingum en TMRM við vandlega stýrð skilyrði. Þessir kostir og gallar eru dregnir saman í mikið notaðri yfirlitsgrein um nema fyrir himnuspennu hvatbera.

Metýlenblátt veldur ljósfræðilegum truflunum einmitt við þann styrk sem notaður er í mælingunum. Gleypnisvið þess nálægt 600 til 665 nm skarast við rauða ljósútgeislun nema, þannig að innri síuáhrif, ljósdeyfing og gleypni örvunarljóss eru allt trúverðugir truflunarþættir. Litarefnið er einnig önnur fitusækin katjón og dreifing þess breytist með spennunni sem verið er að mæla. Vörnin er að nota fleiri en eina mæliaðferð ásamt blankprófum: nemann einan, litarefnið eitt, nemann ásamt hverjum litarefnisstyrk, fulla afskautun með FCCP sem núllviðmið og helst annan nema með ólíka ljóseiginleika. Rannsóknin á framhjáhlaupi við fléttu III setti slíkt fordæmi með því að endurtaka mælingu á endurheimt himnuspennu með bæði safraníni O og TMRM eftir hömlun með antímýsíni og mýxóþíasóli og fá sams konar endurheimt. Einn ljósfræðilegur merkjagjafi gefur vísbendingu. Tveir óháðir merkjagjafar veita sönnunargögn.

Þrjár sýnagerðir, þrjár ólíkar spurningar

Einangraðir hvatberar, frumur með gegndræpa frumuhimnu og heilar frumur eru ekki skiptanlegar næmnistillingar á einu prófi. Þetta eru ólíkar nálganir sem byggjast á ólíkum meginreglum.

Einangraðir hvatberar varðveita rafeindaflutningskeðjuna, innri himnuna og starfskerfi innra rýmisins, en frumuhimnan, umfrymisvökvinn og netgerðin eru fjarlægð. Það er einmitt tilgangurinn: hvarfefni, ADP, hemlar og styrkur litarefnis eru skilgreind nákvæmlega, svo hægt er að ákvarða ferilinn. Fórnarkostnaðurinn er að missa náttúrulegt hvarfefnaframboð, boðmiðlun og orkuþörf.

Frumur með gegndræpa frumuhimnu halda hvatberunum innan stórs hluta frumugerðarinnar en hleypa utanaðkomandi hvarfefnum og ADP í gegnum opnaða frumuhimnuna. Þær eru rétta verkfærið til að staðsetja galla í hvarfefnaferli innan frumulegs samhengis. Of mikil gegndræping skemmir ytri himnuna og stjórnun úr umfrymisvökvanum skolast út.

Heilar frumur varðveita allt: hindrun frumuhimnunnar, afoxunarefni í umfrymisvökvanum, flutning innrænna hvarfefna, hvatberanetið og ATP-þörfina. Þær eru næstar lífeðlisfræðinni og fjærstar sjálfum verkunarferlinum, því upptaka, afoxun og binding litarefnis móta öll hversu mikið af því nær í raun til hvatberanna.

TEGDMA-rannsóknin notaði öll þrjú stigin markvisst: einangraða heilahvatbera til að kanna endurheimt oxunar og spennu með litarefninu, stofnfrumur úr tannkviku með gegndræpa frumuhimnu aðallega til að staðsetja röskunina í hvarfefnaoxun tengdri fléttu I og heilar stofnfrumur til að meta nettóáhrif 2 uM af litarefninu á bælda súrefnisnotkun í lífeðlisfræðilegu samhengi. Fyrir lesendur sem bera saman hvatberamælingar milli sýnagerða veitir fylgigreinin um hvernig metýlenblátt flytur rafeindir um öndunarkeðjuna bakgrunn um ferlana, og leiðarvísirinn um lestur rannsókna á metýlenbláu og öndun fjallar um forsendur styrkvals og notkunar hemla.

Viðmiðunarprófanir sem oxunar-afoxunarvirkt litarefni krefst

Efni sem fer í gegnum endurteknar oxunar-afoxunarhringrásir þarf lengri lista af viðmiðunarprófunum en venjulegur hemill, því efnaferli litarefnisins eins og sér geta líkst líffræðilegum ferlum.

Við öndunarmælingar skal nota hólf með eingöngu stuðpúðalausn til að meta rek, hólf með stuðpúðalausn og litarefni án líffræðilegs efnis, litarefni ásamt öllum utanfrumuafoxunarefnum sem eru í prófinu og að lokum rótenón ásamt antímýsíni til að skilgreina súrefnisnotkun utan hvatbera í heilum frumum. Athugið að afoxað litarefni oxast aftur með því að flytja rafeindir til súrefnis og mynda vetnisperoxíð. Því vanmetur blankpróf með litarefni einu sér, án rafeindagjafa, þá frumulausu súrefnisnotkun sem kemur fram þegar NADH eða NADPH verður tiltækt.

Fyrir vetnisperoxíð skal frekar nota kvarðað Amplex UltraRed ásamt peroxídasa úr piparrót en ósértæk DCFDA-litarefni, staðfesta með katalasa og prófa áhrif lýsingar, þar sem litarefnið er ljósnæmandi efni. Heilahvatberarannsóknin sýndi að peroxíðálagið jókst meira en fjórfalt við aðeins 100 nM af litarefninu á sama tíma og brotthvarf hægði á sér. Peroxíð myndaðist beint fyrir tilstilli afoxaðs litarefnis án súperoxíðs sem milliefnis. Nánari umfjöllun um val á nemum og viðmiðunarprófanir fyrir ljós er í fylgigreininni um mælingu hvarfgjarnra súrefnissambanda í tilraunum með litarefni, og víðari spurningin um hvenær peroxíð virkar sem boðefni fremur en álag er rædd samhliða oxunar-afoxunarjafnvægi frumna og fullyrðingum um andoxunarefni.

Til að styðja fullyrðingar um ferla skal prófa bæði hömlunarset fléttu III: antímýsín A á Qi-setinu og mýxóþíasól á Qo-setinu, ásamt lokaprófun á fléttu IV með sýaníði. Fyrri rannsókn á músarheilum greindi frá því að litarefnið endurheimti öndun sem rótenón hafði hamlað en ekki öndun sem antímýsín hafði hamlað. Síðari rannsókn á þremur tegundum sýndi hins vegar endurheimt að hluta með báðum hemlunum og vísbendingar um beina afoxun cýtókróms c. Líta ætti á framhjáhlaupið sem samrýmanlegt nýrri gögnunum fremur en fullstaðfest, þar sem styrkur litarefnis, hömlunarset, hvarfefnaástand og dreifing litarefnis hafa öll áhrif á hvaða leið sést.

Tafla fyrir val á mæliaðferð

Notaðu þessa töflu til að velja mælinguna út frá spurningunni, ekki öfugt.

Til að fullyrðing sé sannfærandi þarf að lágmarki að nota sömu litarefnisstyrki, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM, við mælingar á súrefnisflæði við lekaskilyrði og með ADP, ólígómýsíni og aftengiefni, hraða ATP-myndunar, himnuspennu helst með tveimur nemum og kvarðaðri losun peroxíðs með katalasa og frumulausum viðmiðunarprófunum. Greinið frá tengdu heildinni: súrefnisflæði ásamt ATP-myndunarhraða, ATP á hvert súrefni, spennu og peroxíði. Hver þessara talna ein og sér er mæling sem leitar að merkingu.