Gerð kvörðunarferils fyrir metýlenblátt: núllsýni, svið og línuleiki

Tveir greinendur nota sömu stofnlausnarflösku af metýlenbláu og útbúa hvor sinn kvörðunarferil. Sá fyrri fær beina línu í gegnum upphafspunktinn og mælir óþekkt sýni af öryggi. Sá síðari fær línu sem sveigist við efri mörkin, skurðpunkt sem fæst ekki nálægt núlli og sýnaniðurstöður sem breytast við þynningu. Sama litarefni, sama mælitæki, sama bylgjulengd. Munurinn liggur ekki í færni. Hann liggur í hönnuninni: hvað var í núllsýninu, hvaða styrkir voru valdir og hvort prófaða sviðið hélt sig innan þess svæðis þar sem eitt einfalt líkan gildir enn.

Kvörðunarferill er samkomulag milli svörunar mælitækis og styrks, sem gildir aðeins við þær aðstæður sem ríktu þegar hann var gerður. Fyrir metýlenblátt hefur það samkomulag þekktan veikleika. Litarefnið myndar sameindaþyrpingar í vatni, þannig að þær sameindaformgerðir sem gleypa ljós breytast með styrknum. Ferill sem spannar slíka breytingu verður ekki beinn og engin tölfræðivinnsla getur lagað það. Þessi grein sýnir hvernig hanna má ferilinn þannig að línan hafi merkingu: velja rétt núllsýni, halda styrksviðinu innan þess svæðis þar sem einliður eru ríkjandi, framkvæma raunverulegar endurtekningar og líta á sveigju sem upplýsingar fremur en suð.

Byrjaðu á núllsýninu, ekki stöðlunum

Núllsýnið skilgreinir núllið og fyrir metýlenblátt verður það að innihalda allt nema litarefnið. Sömu vatnsgæði, sama stuðpúða og pH, sömu sölt, sama hlutfall meðleysis og sama hitastig. Útbúðu kvörðunarsýnin í nákvæmlega sama sýnafylki. Ástæðan er efnafræðileg, ekki formsatriði. Salt og leysir hliðra jafnvæginu milli einliða, tvíliða og stærri sameindaþyrpinga, sem breytir litrófinu við mælibylgjulengdina. Núllsýni sem inniheldur aðeins vatn getur ekki leiðrétt breytingu á dreifingu sameindaformgerða sem stafar af sýnafylkinu. Í heildargreiningu á litrófum metýlenblatts í vatni, sem er aðgengileg í opinni útgáfu greinarinnar, var styrk natríumklóríðs breytt frá 0 til 0.15 M einmitt vegna þess að jónastyrkur hliðrar jafnvæginu, og myndun sameindaþyrpinga jókst með salti.

Ein hagnýt afleiðing: kvarðaðu aldrei í afjónuðu vatni og mældu síðan sýni í fosfatstuðpúða eða síuðu skólpvatni. Þegar ekkert sýnafylki án greiniefnis er til staðar er staðalviðbót í sýnið sjálft betri kostur en ytri kvörðunarferill í ósamsvarandi fylki. Tengdar leiðbeiningar um að tryggja áreiðanleika greininga í vatnslausn má finna í umfjölluninni um sýnafylki og truflanir, og almennar meginreglur magngreininga á litarefnum eru teknar fyrir í yfirlitinu um hönnun greiningaraðferða.

Veldu svið þar sem ein sameindaformgerð er ríkjandi

Magngreining við langbylgjugleypnibandið nálægt 664 nm gerir ráð fyrir að megnið af litarefninu sé á einliðuformi. Í hreinu vatni gildir sú forsenda aðeins meðan lausnirnar eru þynntar, gróflega á lága míkrómólarsviðinu. Birtar hallatölur úr mælingum sýna hvar mörkin liggja: kvörðun sem er haldið undir um 7 míkrómólar í 1 cm kúvettum gefur hallatölu nálægt 82,000 M-1 cm-1, en kvörðun sem nær upp í um 37 míkrómólar lækkar hana í um 67,100 vegna þess að sterkustu staðlarnir innihalda þegar töluvert af tvíliðum. Allir stuðlar sem hér eru nefndir eru birtir ásamt mæliaðstæðum í litrófsyfirlitinu fyrir metýlenblátt, sem er rétti staðurinn til að bera saman tölur; í þessari grein eru þeir aðeins notaðir til að ákvarða sviðið.

Hönnunarreglurnar leiða beint af þessu:

1. Hafðu sterkasta staðalinn nægilega þynntan til að lögun litrófsins haldist stöðug. Við þróun aðferðarinnar skaltu skanna allt sýnilega sviðið (um 550 til 750 nm) fyrir hvert styrkþrep í stað þess að mæla við eina bylgjulengd. Ef stöðluð litróf breyta um lögun með styrk er efnafræðin að breytast og sviðið er of vítt.
2. Fylgstu með hlutfalli gleypni nálægt 610 nm og gleypni nálægt 665 nm yfir styrkþrepin. Hlutfall sem hækkar með styrk merkir að tvíliðuöxlin er að vaxa og einliðulíkanið stenst ekki lengur. Þessi vísbending er skýrð nánar í leiðbeiningunum um sameindaþyrpingar og áhrif styrks.
3. Notaðu 1 cm kúvettu við vinnu á lága míkrómólarsviðinu. Með hallatölu nálægt 82,000 gefa 5 míkrómólar gleypni nálægt 0.41 og 10 míkrómólar um 0.82, hvort tveggja innan þægilegs mælisviðs flestra tækja.
4. Fyrir sterkar stofnlausnir skaltu stytta ljósveginn í stað þess að sætta þig við gleypni langt yfir 1, en mundu að stuttur ljósvegur lagar ljósmælinguna, ekki efnafræðina. Myndun sameindaþyrpinga ræðst af styrk, ekki ljósvegslengd, svo sterk stofnlausn þarf enn sína eigin meðferð sem tekur mið af sameindaformgerðum fremur en feril fyrir þynnta einliðulausn.

Heildaraðlögunin sem stór hluti þessarar myndar byggist á náði yfir 224 litróf frá 1.1 míkrómólar til 3.4 millímólar og sýndi að merki frá fjórliðum var þegar greinanlegt undir 34 míkrómólar. Sú niðurstaða gefur tóninn: línulega sviðið er þrengra en ætla mætti, svo sannreyndu það í stað þess að ganga að því vísu.

Styrkþrep, endurtekningar og röð

Ferill með þremur punktum sannar ekkert. Leiðbeiningar ICH Q2(R2) um fullgildingu gera ráð fyrir að minnsta kosti fimm styrkjum til að meta línuleika, og sex til átta styrkþrep yfir núlli gefa sannfærandi vinnuferil, sérstaklega nálægt efri mörkunum þar sem myndun sameindaþyrpinga hefst. Dreifðu þrepunum þannig að þau nái yfir fyrirhugað styrksvið sýnanna, með fleiri punktum þar sem sveigja er líklegust, fremur en að velja margfeldisröð til hægðarauka.

Mældu hvert þrep tvisvar eða þrisvar, með lausnum sem eru útbúnar sjálfstætt, fremur en að mæla þrisvar úr sömu flösku. Sjálfstæðar endurtekningar leiða í ljós skekkjur við undirbúning; endurteknar mælingar úr einni flösku sýna aðeins suð mælitækisins. Í heildarrannsókninni frá 2020 var hver lausn mæld þrisvar, sem er enn traust viðmið. Veldu mælingaröðina af handahófi svo að rek, aðsog á gler eða hitabreyting geti ekki líkst sveigju. Rannsókn á kvarskúvettum sýndi að um 3 prósent litarefnisins úr 34 míkrómólar lausn aðsogaðist innan 10 mínútna. Haltu því snertitíma, kúvettu, hreinsun og verklagi samræmdu í allri mælingaröðinni.

Skýringardæmi með útreikningum (ekki mæligögn)

Tölurnar hér að neðan eru tilbúnar til að sýna útreikningana. Þær eru ekki mælingar af rannsóknarstofu og má ekki vitna í þær sem gögn um metýlenblátt. Það sem skiptir máli er hvernig þær eru sannreyndar.

Gerum ráð fyrir sex stöðlum í samsvarandi stuðpúða, með 1 cm ljósveg, mældum við 665 nm miðað við samsvarandi núllsýni:

Aðlögun beinnar línu að meðalgleypni sem falli af styrk gefur hallatölu nálægt 0.0805 gleypnieiningum á míkrómólar og skurðpunkt innan nokkurra millígleypnieininga frá núlli. Með því að deila hallatölunni með ljósvegslengdinni fæst sýndargleypnistuðull: 0.0805 á míkrómólar jafngildir um 80,500 M-1 cm-1, sem samræmist sviði í vatni þar sem einliður eru ríkjandi. Sannprófunin sem skiptir máli er ekki R í öðru veldi, sem mun líta frábærlega út hvort sem er. Hún felst í skurðpunkti nálægt núlli, stöðugu A610/A665 hlutfalli frá S2 til S5 og leifum sem dreifast án leitni. Hækkun hlutfallsins við S6 er raunveruleg vísbending um að annaðhvort sleppa því þrepi eða merkja 7 míkrómólar sem bráðabirgðaefri mörk fyrir þessa samsetningu sýnafylkis og mælitækis.

Óþekkt sýni sem mælist 0.245 við sömu aðstæður má umreikna beint: 0.245 deilt með 0.0805 á míkrómólar gefur um 3.0 míkrómólar, áður en tekið er tillit til þynningarstuðuls sýnisins. Skráðu niðurstöðuna ásamt aðstæðum: bylgjulengd, ljósvegslengd, sýnafylki núllsýnis, kvörðunarsviði og dagsetningu.

Útfyllanlegt vinnublað fyrir kvörðun

Afritaðu þetta sniðmát í rannsóknarskrána fyrir hvert nýtt sýnafylki. Eitt sýnafylki, eitt blað, einn ferill.

Línan um form hvarfefnis á fullt erindi á blaðið. Metýlenblátt sem selt er getur verið vatnsfrítt salt eða hýdrat, svo sem þríhýdrat, og rangur mólmassi skekkir alla nafnstyrki án þess að það sé augljóst. Athuganir á hreinleika og forskriftum upphafsefnisins eru teknar fyrir í leiðbeiningunum um gæði og gæðaflokka.

Sannreyndu með sjálfstæðum eftirlitsstaðli

Kvörðunarferill á aldrei að leggja mat á eigin heimavinnu. Eftir að línan hefur verið aðlöguð skaltu útbúa einn eftirlitsstaðal úr stofnlausn sem byggist á aðskildri vigtun, með styrk nálægt miðju samþykkta sviðsins, og mæla hann sem óþekkt sýni. Samræmi innan nokkurra prósenta staðfestir undirbúningsferlið; frávik bendir til stofnlausnarinnar eða þynninganna fremur en mælitækisins. Mældu eftirlitsstaðalinn aftur með hverri sýnalotu. Ef niðurstaðan rekur á meðan ferillinn er óbreyttur skaltu gruna vinnulausnirnar eða kúvettuna áður en þú grunar sýnin. Þessi eina venja grípur flestar duldu skekkjurnar: mólmassa hýdrats sem er notaður fyrir vatnsfrítt efni, örpípettu sem er ekki rétt kvörðuð eða stuðpúða sem er útbúinn með röngum jónastyrk. Skráðu endurheimt eftirlitsstaðalsins á vinnublaðið við hlið hallatölunnar, svo síðar megi sjá að línan var prófuð, ekki aðeins teiknuð.

Að túlka ólínuleika til að greina orsökina

Þegar ferillinn sveigist bendir lögun fráviksins til orsakarinnar. Niðursveigja við mikla gleypni með óbreyttri litrófslögun bendir til mælitækisins, oft flökkuljóss sem veldur vanmati á mikilli gleypni. Sveigja ásamt vaxandi öxl við 610 nm bendir til efnafræðinnar: tvíliður og stærri sameindaþyrpingar gleypa ljós öðruvísi en einliður. Núllsýni sem fæst ekki á núll eða staðlar sem lækka með tíma benda til ílátsins: aðsogs á gler eða kúvettur, sérstaklega ef snertitímar voru mismunandi í mælingaröðinni. Og snyrtileg lína í gegnum punktana sem gefur samt rangar sýnaniðurstöður bendir til sýnafylkisins: sýnin eru ólík kvörðunarsýnunum, svo endurgerðu ferilinn í sýnafylki sýnanna eða skiptu yfir í staðalviðbót. Teiknaðu leifar sem fall af styrk í öllum tilvikum. Tilviljanakennd dreifing styður líkan beinnar línu; bros- eða skeifulaga mynstur hrekur það með áreiðanlegri hætti en nokkur þröskuldur fyrir R í öðru veldi, atriði sem leiðbeiningar um fullgildingu taka sérstaklega undir.

Metýlenblátt umbunar þessum aga. Einliðuband þess er sterkt, efnafræðin er vel þekkt og merki um það sem fer úrskeiðis birtast í litrófinu áður en tölurnar skekkjast. Gerðu ferilinn yfir þröngt svið, notaðu rétt núllsýni, útbúðu endurtekningarnar sjálfstætt og láttu lögun litrófanna ráða sviðinu. Línan sem fæst er stutt, en hver punktur á henni er réttur.

Skýringarútreikningar í þessari grein nota tilbúnar tölur til að sýna aðferðina. Mældir viðmiðunarstuðlar ásamt öllum mæliaðstæðum eru í tengda litrófsyfirlitinu og rannsóknin á sameindaþyrpingum sem liggur til grundvallar er skráð undir PMID 33251415.