Hver þróaði fjólubláu blóðlitunina? Metýlenblátt, Malachowski, Romanowsky og Giemsa

Eósín er rautt. Metýlenblátt er blátt. Blandaðu þeim saman, berðu blönduna á þurrkað blóðstrok og hlutar stroksins verða fjólubláir.

Ekki allir hlutar þess. Í vel útbúnu sýni verða kjarnar hvítra blóðkorna rauðfjólubláir og inni í malaríusníkjudýri tekur litnið á sig sama lit, á meðan rauðu blóðkornin í kring haldast bleik og umfrymið gráblátt. Fjólublái liturinn gerir kleift að greina frumugerðirnar hverja frá annarri.

Hvorug flaskan inniheldur fjólubláan lit. Liturinn kemur aðeins fram þegar tiltekið niðurbrotsefni metýlenblás mætir eósíni á smásjárglerinu. Á níunda og tíunda áratug 19. aldar vissi enginn að þetta efni væri til, hvað þá hvað það væri. Þeir sem leituðu að litnum unnu einir með óhrein litarefni og höfðu enga áreiðanlega leið til að komast að því hvað væri í flösku eftir að hún hafði staðið á hillu í tvo mánuði.

Þess vegna á spurningin í titlinum fleiri en eitt verjandi svar, og þess vegna breyttist svarið árið 2011.

Það sem sást breyttist með blöndunni

Litunin var ekki fundin upp í einu vetfangi. Hún varð til smám saman. Hver breyting á blöndunni bætti við nákvæmlega einni nýrri sýnilegri vísbendingu, og röð þessara vísbendinga er skýrasta leiðin til að lesa söguna.

Mynstrið í síðasta dálkinum er það sem skiptir máli. Hvert framfaraskref víkkaði litasviðið, og hver víkkun gerði eina byggingu til viðbótar sýnilega. Fjólublái liturinn er ekki skraut í aðferðinni; hann er munurinn á því að sjá að sníkjudýr sé til staðar og að sjá úr hverju það er gert. Hvernig litarefnið sjálft fór úr litarefnaverksmiðju BASF inn í læknisfræðina er lengri saga með sínar eigin heimildir. Öll atburðarásin hér að ofan, með heimild fyrir hverri færslu, er varðveitt sem tímalína framlaganna með tenglum á heimildir.

Mynd: sömu sex blöndurnar sýndar út frá því hvað var í skálinni og hvað kom úr henni. Hringirnir sýna litarefnin; reitirnir fyrir neðan sýna litina sem þau gátu myndað í blóðstroki. Engin blanda fyrir 1890 sýnir rauðfjólubláan reit og engin eftir það sleppir honum.

Maðurinn sem notaði bórax af ásetningi

Ernst Malachowski var læknir í Breslau, sem nú heitir Wrocław. Hann starfaði alla starfsævina á eigin læknastofu og á lítilli lækningastöð sem hann rak með samstarfsmanni, en vann rannsóknarstofuvinnu í frítíma sínum. Hann fæddist í Strzelno 12. mars 1857, lærði læknisfræði við Háskólann í Breslau og starfaði frá 1882 til 1887 sem aðstoðarlæknir í lyflækningum á Allraheilagraspítalanum, sem þá var næststærsti spítali Þýskalands.

Hann hóf vinnuna árið 1888 með tvílitun Chęcińskis og Plehns. Í sýni sem hann útbjó árið 1889 sá hann litni kjarnans í malaríusníkjudýrinu litast öðruvísi en umfrymið, en komst síðan að því að hann gat ekki endurtekið það. Hann reyndi að sýra metýlenbláa lausnina, sem gerði illt verra. Hann reyndi að gera hana basíska með bóraxi, og það virkaði í hvert sinn. Hann sýndi aðferðina opinberlega 15. júní 1890 og birti ítarlegri lýsingu í ágúst 1891, þar á meðal leiðbeiningarnar um bóraxið. Hann tók fram að litunin tæki tuttugu og fjórar klukkustundir og að auðvelt væri að endurtaka niðurstöðurnar.

Tuttugu og fjórar klukkustundir eru langur tími á greiningarrannsóknarstofu, og grein hans fjallaði ekki ítarlega um fjólurauðan lit kjarna sníkjudýrsins. Hver sem ástæðan var tók enginn upp markvissa basavæðingu metýlenblás fyrr en Nocht gerði það aftur árið 1898. Malachowski skrifaði aldrei aftur um blóðlitun.

Ástæðan fyrir því að svo lítið var vitað um hann þar til nýlega liggur fremur í varðveislu skjala en einhverri ráðgátu. Nánast engin ummerki um ævi hans varðveittust í læknisfræðiritum, og það sem varðveittist barst eftir einni leið. Marie, dóttir hans, fór frá Þýskalandi til London árið 1939, þjónaði í breska hernum og settist að í Kanada. Safn hennar af fjölskylduskjölum endaði hjá Leo Baeck Institute í New York. Leo, bróðir hennar, féll í fyrri heimsstyrjöldinni. Eva, systir hennar, var flutt nauðungarflutningum frá Breslau í flutningsbúðirnar í Izbica í apríl 1942 og sneri aldrei aftur. Hedwig, móðir hennar, svipti sig lífi 22. apríl 1942 fremur en að bíða sömu nauðungarflutninga. Malachowski hafði látist árið 1934, áður en allt þetta gerðist.

Fjölskyldusaga sem endar þannig er fjölskyldusaga sem hætt er að vitna til. Greinarnar tvær sem færðu Malachowski aftur inn í þróunarsögu litunarinnar, báðar birtar árið 2011, voru unnar upp úr skjalasafnsgögnum í Poznań og Wrocław og skjölum Marie í New York.

Mygluð flaska og heppinn Rússi

Dmitri Romanowsky lærði læknisfræði við Herlæknaháskólann í Sankti Pétursborg og vann við malaríurannsóknir lengstan hluta starfsævinnar. Árið 1890 birti hann aðferð sem var, á pappírnum, nánast eins og aðferð Chęcińskis: óbreytt metýlenblátt og eósín, með örlítið meira eósíni.

Í september 1891 birti hann aðferðina sem gerði nafn hans þekkt, og lykilatriðið var falið í leiðbeiningunum. Bestu niðurstöðurnar fékk hann með birgðalausninni af metýlenbláu, lausn sem hafði staðið í meira en tvo mánuði og mygla vaxið á henni. Myglan og tíminn sem lausnin stóð höfðu afmetýlerað litarefnið að hluta. Romanowsky vissi það ekki og gat ekki stjórnað því, og aðrir sem reyndu aðferð hans gátu ekki fengið fjólubláa litinn fram. Ritgerð hans hafði verið lögð fram í Sankti Pétursborg í júní 1891, og þess vegna er 1891 talið uppgötvunarárið í hefðbundinni frásögn.

Sýnikennsla Malachowskis hafði farið fram í júní 1890, rúmu ári fyrr, og aðferð hans virkaði af ásetningi.

Hvers vegna litunin var nefnd eftir röngum manni

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann og Barbara Oleksyn settu saman rökin fyrir hlut Malachowskis, og þau byggjast á fjórum atriðum. Dagsetningu opinberu sýnikennslunnar, júní 1890 á móti september 1891. Orðinu markvisst á móti orðinu tilviljunarkennt. Því að Malachowski birti aðferð sína, með bóraxi og öllu, á meðan aðferð Romanowskys var háð breytu sem hann gat ekki stjórnað. Og þeirri athugun að lýsingin á kjarna malaríusníkjudýrsins, ásamt fjólubláa litnum sem sýndi hann, hvarf í raun úr fræðiritum í sjö ár vegna þess að enginn gat endurtekið tilviljanakenndu útgáfuna.

Þau draga enga dul á niðurstöðuna. Í ævisögugreininni kalla þau þessa eignun heiðursins „skrumskælingu“ og vitna í Ralph Lillie, sem skrifaði árið 1978 að „ef til vill ættum við að kalla þennan flokk litunaraðferða Malachowski-litanir“.

Þessari fullyrðingu er mótmælt, eins og yfirleitt gerist þegar deilt er um hver hafi verið fyrstur, og eðli deilunnar er þess virði að útskýra fremur en að skera úr um hana. Röksemdafærsla um hver hafi verið fyrstur verður að skilgreina hvað uppgötvunin var. Ef uppgötvunin er fjólublái liturinn á Malachowski fyrri skjalfestu sýnikennsluna. Ef uppgötvunin er birt aðferð birtu báðir mennirnir árið 1891 og litunin var nefnd eftir Romanowsky. Ef uppgötvunin er skýringin getur hvorugur gert tilkall, því hvorugur vissi að þroskunin væri afmetýlering og hvorugur gat sagt hvers vegna liturinn birtist yfirhöfuð. Þetta síðasta atriði er það sem almennar frásagnir sleppa. Virka efnið var óhreinindi sem enginn hafði borið kennsl á, og sá fyrsti sem framkallaði litinn markvisst gerði það með endurtakanlegri uppskrift sem byggðist á reynslu, ekki á skilningi á því hvað uppskriftin gerði.

Greinarnar tvær frá 2011 eru ítarlegasta birta röksemdafærslan fyrir hlut Malachowskis, og báðar má lesa ókeypis á PubMed: langa yfirlitsgreinina á PMID 21235291 og ævisögugreinina á PMID 21660627. PubMed-færslan fyrir yfirlitsgreinina vísar einnig í athugasemd við hana sem birtist í sama tímariti síðar það ár, í 86(5):366. Það er viðeigandi áminning um að röksemdafærslunni var mótmælt á prenti um leið og hún birtist.

Deilan snýst ekki um ágreining um efnafræðina. Allir sem koma að henni eru sammála um hvað fjólublái liturinn er og hvaða efnisþættir mynda hann. Ágreiningurinn snýst um hver komst þangað fyrstur og hvort tilviljun sem enginn gat endurtekið teljist yfirhöfuð vera að hafa komist þangað.

Hvað síðari nöfnin bættu við

Ef Malachowski framkallaði fjólubláa litinn fyrstur, hvers vegna ber litunin nöfn Romanowskys, Wrights og Giemsa?

Vegna þess að litun sem virkar einu sinni í höndum upphafsmanns síns er ekki hvarfefni. Síðari vinnan breytti duttlungafullri blöndu í eitthvað sem tæknir í öðru landi gat notað á þriðjudegi.

Nocht komst þangað með rökhugsun. Eftir að hafa ekki fengið áreiðanlega niðurstöðu með einföldu hlutlausu litarefni komst hann að þeirri niðurstöðu að fjólublái liturinn hlyti að stafa af einhverju í metýlenbláu lausninni sem væri ekki metýlenblátt, og fór að leita að því. Unna hafði þegar tekið eftir því að gamlar metýlenbláar lausnir lituðu korn mastfrumna rauð og lagt til að nýtt efni myndaðist þegar litarefnið þroskaðist. Bernthsen hafði sýnt árið 1885 að basískar aðstæður fjarlægja metýlhópa af metýlenbláu og að þessar afurðir eru það sem við köllum nú asúr-litarefni. Nocht dró virka hlutann út með klóróformi og gat aðeins kallað hann rautt úr metýlenbláu; Michaelis nefndi hann azure I árið 1901. Jenner leysti vandann við meðhöndlunina. Með því að leysa botnfall metýlenblás og eósíns aftur upp í vatnsfríu metanóli fékkst ein stöðug lausn sem festi strokið um leið og hún litaði það og gerði hitafestingu óþarfa. Leishman og Reuter sameinuðu fjöllitað litarefni og alkóhólleysiefni og fengu bæði stöðugleika og fjólubláa litinn. Wright skipti út tólf klukkustunda hitun við 65 °C og tíu daga bið fyrir eina klukkustund í streymandi gufu. Giemsa hætti alveg að treysta á lausn sem hafði þroskast af handahófi og notaði afmælt magn þekktra litarefna með glýseróli í metanólinu, svo varan þyldi hitann í hitabeltinu. Hann birti aldrei hvernig hann framleiddi hreint metýlenasúr. Hann seldi það rannsóknarstofu Dr Grübler í Leipzig, sem markaðssetti það sem azure I og hélt því fram að aðeins hennar útgáfa væri ekta Giemsa-litunarlausn.

Enn er deilt um hvað þetta asúr-litarefni var. Sumir telja að það hafi einfaldlega verið fjöllitað metýlenblátt, aðrir að það hafi verið ríkt af azure B. Svarið kom í kjölfar stríðs. Þegar þýsk litarefni urðu ófáanleg komst teymi frá bandarísku lýðheilsustofnuninni, Ralph Lillie ásamt Maurice Roe og Aimee Wilcox, að því að besta litunin fékkst með þremur aðskildum efnisþáttum: óbreyttu metýlenbláu, afmetýleruðu niðurbrotsefni þess, azure B, og eósíni. Azure B kom í stað azure I, sem ekki var fáanlegt, og þessir þrír efnisþættir eru enn grunnurinn að lituninni sem er notuð til að greina malaríu í dag.

Efnafræðin að baki samspili þessara þriggja efnisþátta á smásjárgleri er sérstök spurning og efni annarrar síðu. Hlutverk litarefna og efnafræði litana af Romanowsky-gerð fjallar um hvað azure B og eósín gera hvort um sig og hvers vegna þau mynda saman lit sem hvorugt myndar eitt og sér. Síðan um smásjárskoðun og notkun á rannsóknarstofum fjallar um hagnýtu hliðina: hvað tiltekið sýni sýnir og hvernig meta má hvort ákveðin vara henti aðferðinni sem ætlunin er að nota.

Sá hluti sögunnar sem á enn við

Eitt atriði í þessari sögu hætti ekki að eiga við árið 1902. Í um það bil fimmtíu ár var mikilvægasti efnisþátturinn í staðlaðri malaríulitun heimsins óhreinindi án nafns. Þau voru þar fyrir tilviljun, magn þeirra var mismunandi eftir flöskum, hver þau voru var viðskiptaleyndarmál hluta þess tíma og deilt var um hlutfall þeirra fram á fimmta áratug 20. aldar. Þeir sem notuðu litunina voru ekki kærulausir. Þeir höfðu enga leið til að vita hvað var í flöskunni.

Nútímaútgáfa sama vanda er forskrift sem lýsir aðeins hluta efnisins. Samræmi við USP er leiðin að mesta hreinleika sem markaðurinn býður, því USP er heildstæður birtur staðall en ekki stök mæling: auðkenning, hreinleiki, lífræn óhreinindi þar á meðal asúr-litarefnin, leysiefnaleifar, frumefnaóhreinindi, glæðileifar, örverumörk og innri eiturefni baktería. Blupreme fær metýlenblátt frá lyfjaframleiðanda og birtir full greiningarvottorð, svo hægt sé að sannreyna hvern lið listans í stað þess að láta fullyrðingar nægja. Vottorð sem greinir frá mælingu á þungmálmum og kallar það samræmi við USP er nútímaígildi flösku sem er merkt „þroskað metýlenblátt“: hugsanlega ágætt hvarfefni, en merkimiðinn segir ekki hvað er í henni.