Túlkun á útliti E. coli og annarra þyrpinga á EMB-agar

Nemandi striksáir óþekktu sýni á eosín-metýlenbláan agar, ræktar það yfir nótt og kemur aftur að skál með dökkum þyrpingum sem glampa grænt. Í vinnubókinni stendur „E. coli, staðfest.“ Sú færsla fullyrðir meira en skálin getur stutt. Skálin sýnir svipgerð vaxtar og gerjunar við tilteknar aðstæður. Tegundargreining er sérstök niðurstaða sem krefst sjálfstæðra gagna.

Þessi leiðarvísir fjallar um niðurstöður á EMB-agar sem túlkunarverkefni. Hann útskýrir meginhugmyndina, fer yfir myndasafn skála með viðmiðum og nefnir tilvik þar sem kennslubókarútlitið er villandi.

Hugmyndin að baki skálinni

EMB-agar er bæði valæti og aðgreiningaræti. Litarefnin eosín Y og metýlenblátt hamla mörgum Gram-jákvæðum örverum, svo ætið stuðlar frekar að vexti Gram-neikvæðra örvera. Sömu litarefni virka sem vísar: þegar örvera gerjar sykurinn sem er til staðar og myndar nægilega mikla sýru staðbundið tekur þyrpingin mikið litarefni upp og verður dökkfjólublá til blásvört. Við öfluga sýrumyndun getur yfirborð þyrpingarinnar sýnt grænan málmgljáa sem breytist með sjónarhorni. Verklýsing ASM fyrir eosín-metýlenbláar agarskálar lýsir þessari samsetningu val- og aðgreiningaráhrifa og veitir viðmiðunarljósmyndir til kennslu.

Eitt atriði skiptir máli áður en nokkur niðurstaða er túlkuð: athugaðu hvaða samsetning er notuð. Eldri Holt Harris Teague-samsetningin inniheldur bæði laktósa og súkrósa, en Levine EMB inniheldur aðeins laktósa. Örvera sem gerjar súkrósa en ekki laktósa, eins og margir stofnar Serratia marcescens, getur litið mismunandi út á þessum tveimur gerðum. Leiðbeiningar framleiðanda fyrir EMB-æti tilgreina þennan mun á samsetningu sérstaklega. Skráðu framleiðanda og samsetningu í vinnubókina ásamt niðurstöðunni.

Tilbúinn ósáður EMB-agar er yfirleitt rauðbrúnn til rauðfjólublár, stundum með grænleitum blæ eða fíngerðu botnfalli. Þessi bakgrunnslitur er ekki vöxtur. Berðu hverja athugun saman við ósáða skál eða skráð grunnástand og lestu af upphaflegu skálinni eftir um 18 til 24 klukkustunda loftháða ræktun við 35 til 37 C, nema verklýsing kennslunnar kveði á um annað. Lengri ræktun getur breytt útliti gerjunar.

Hvernig á að skoða skálina

Notaðu tvenns konar lýsingu. Skoðaðu fyrst skálina í endurköstuðu eða skástæðu ljósi og hallaðu henni: málmgljáinn breytist með sjónarhorni og getur birst eða horfið eftir því hvernig horft er á skálina. Skoðaðu hana síðan í gegnumfallandi ljósi til að meta lit þyrpinganna og dökkar miðjur. Byggðu matið á vel aðskildum þyrpingum, þar sem þéttur vöxtur og nálægar þyrpingar breyta staðbundinni sýrusöfnun og geta dregið úr lit eða ýkt hann. Myndasafn ASM sýnir þetta beint: E. coli í blandaðri rækt getur misst þann gljáa sem búist er við vegna þess að örverur í kring breyta sýruumhverfinu.

Hafðu viðmið með þegar æfingin leyfir. Algengt viðmiðunarsafn í kennslu er E. coli ATCC 25922 fyrir blásvarta svipgerð með málmgljáa, baktería sem gerjar ekki, svo sem Salmonella Typhimurium ATCC 14028 eða Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, fyrir litlausu svipgerðina og Gram-jákvæð baktería, svo sem Enterococcus faecalis eða Staphylococcus aureus, sem hömlunarviðmið, eins og tilgreint er í stöðluðum gæðaeftirlitstöflum fyrir EMB-æti. Ef jákvæða viðmiðið sýnir ekki gljáa skaltu fyrst skoða ræktunaraðstæður, þéttleika vaxtar eða samsetningu ætisins áður en þú dregur ályktanir um óþekkta sýnið.

Myndasafn skála til skýringar

Myndirnar af skálunum hér að neðan eru útbúnar skýringarmyndir, ekki ljósmyndir af raunverulegum ræktum. Þær sýna mynstrið sem á að leita að, ekki nákvæman litblæ tiltekins stofns. Berðu þær saman við viðmiðunarljósmyndir ASM og raunverulegar skálar á kennslurannsóknarstofunni.

Skál 1: Escherichia coli á EMB-agar, öflug laktósagerjun

E. coli á EMB-agar er yfirleitt dökkfjólublá til blásvört, oft með dökka miðju og grænan málmgljáa vegna öflugrar sýrumyndunar. Gljáinn er hið þekkta einkenni sem nemendur leita að, en líttu á hann sem vísbendingu til stuðnings fremur en skilgreiningu. Styrkur gljáans er breytilegur eftir stofni, ræktunartíma, þéttleika þyrpinga og sjónarhorni. Skortur á gljáa útilokar ekki E. coli og dökk þyrping án gljáa getur bent til ýmissa annarra gerjandi baktería. Veldu vel aðskilda þyrpingu fyrir frekari vinnu í stað þess að lesa af svæði með þéttum vexti.

Skál 2: Klebsiella pneumoniae á EMB-agar, slímkennd gerjandi baktería

Klebsiella pneumoniae á EMB-agar myndar yfirleitt stórar, gljáandi, slímkenndar þyrpingar í bleikfjólubláum til brúnfjólubláum litbrigðum, oft með dökkar miðjur en yfirleitt án sterks málmgljáa. Svipað útlit sést hjá skyldum gerjandi bakteríum, svo sem Enterobacter. Slímkennd áferð og stærð þyrpinga eru hluti af matinu: lítil og flöt bleik þyrping hefur annað vægi en stór, kúpt og slímkennd þyrping. Eins og með E. coli bendir skálin til gerjunarsvipgerðar, en tegundargreining krefst lífefnafræðilegrar staðfestingar sem lýst er hér að neðan.

Skál 3: Salmonella á EMB-agar og aðrar bakteríur sem gerja ekki, litlausar þyrpingar

Salmonella á EMB-agar og skyldar bakteríur sem gerja ekki laktósa, þar á meðal Shigella og margir Pseudomonas-stofnar, vaxa yfirleitt sem litlausar, hálfgagnsæjar eða ljósrafgular þyrpingar. Sumar samsetningar og aðstæður gefa daufan bleikleitan blæ, svo fölbleik þyrping merkir ekki sjálfkrafa að bakterían gerji. EMB greinir ekki Salmonella frá Shigella eða öðrum bakteríum sem gerja ekki; sá greinarmunur fæst með síðari prófum. Athugaðu einnig að skráðir hafa verið laktósajákvæðir Salmonella-stofnar með málmgljáandi þyrpingar sem líkjast E. coli. Það er enn ein ástæða þess að ein skál getur ekki ráðið úrslitum.

Skál 4: Serratia marcescens og gildran í samsetningu ætisins

Serratia marcescens fær sérstakan kafla vegna þess að nemendur búast oft við rauðum þyrpingum og mistúlka síðan skálina. Flestir stofnar úr klínískum sýnum gerja ekki laktósa og því eru þeir yfirleitt fölir eða dauflega litaðir á Levine EMB. Þar sem margir stofnar gerja súkrósa getur samsetning sem inniheldur súkrósa gefið dekkri eða sýrumyndunartengdari svörun. Ekki heldur búast við hinu dæmigerða rauða litarefni prodigiosín við 35 til 37 C; litarefnamyndun er óáreiðanleg við hitastig ræktunarskáps. Þegar verklýsing nefnir Serratia marcescens á EMB-agar skaltu athuga hvaða samsetningu fullyrðingin miðast við. Yfirlit um efnaskipti Serratia dregur saman laktósaneikvætt og súkrósabreytilegt gerjunarmynstur sem liggur að baki þessari gildru.

Skál 5: viðmið og örverur sem verða fyrir hömlun

Gram-jákvæðar örverur, svo sem Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus og Bacillus, verða almennt fyrir hömlun eða verulegri vaxtarskerðingu á EMB-agar, þótt hömlunin sé ekki algjör hjá öllum stofnum. Viðmiðunarsafn heldur túlkuninni á traustum grunni: E. coli-viðmiðið ætti að sýna góðan vöxt með blásvörtum lit og gljáa, viðmiðið sem gerjar ekki ætti að sýna litlausan vöxt og hömlunarviðmiðið ætti að sýna lítinn eða engan vöxt. Ef hömlunarviðmiðið vex vel hefur valvirkni ætisins brugðist og allar aðrar túlkanir úr þeirri lotu eru vafasamar. Litunaraðferðir svara annarri spurningu en ræktunaræti; fyrir litun á smásjárglerjum á rannsóknarstofunni, sjá myndasafn metýlenblárrar litunar.

Samanburður með skýrum takmörkunum

Þrjár setningar draga saman villandi útlit. Dökkt merkir ekki E. coli, þar sem Klebsiella, Enterobacter og aðrar gerjandi bakteríur mynda dökkar miðjur án gljáa. Bleikt merkir ekki Klebsiella, þar sem miðlungsöflugar eða hægar gerjandi bakteríur og sumar bakteríur sem yfirleitt teljast ekki gerja geta verið bleikar eða ljósfjólubláar. Gljái merkir ekki endanlega staðfestingu á E. coli, þar sem aðrar öflugar gerjandi bakteríur geta myndað hann. Kennsluverklýsingin og myndir hennar af blönduðum ræktum sýna hvert þessara frávika.

Takmarkanir staðfestingar

EMB-agar sýnir svipgerð, ekki tegund. Ólíkar örverur geta myndað þyrpingar með sama útliti og ein örvera getur vikið frá kennslubókarútliti sínu eftir stofni, aldri, þéttleika vaxtar, samsetningu ætis og ræktunaraðstæðum. Þess vegna er útlit þyrpinga á EMB talið gefa bráðabirgðavísbendingu bæði í kennslu og klínísku verklagi.

Vinnuferli nemanda sem stenst faglega skoðun er þetta: lýsa aðskildu þyrpingunni (stærð, lit, miðju, gljáa í skástæðu ljósi, slímkenndum einkennum), skrá samsetningu, ræktunartíma og hitastig ásamt viðmiðum; rækta síðan áfram úr vel aðskildri þyrpingu til að fá hreinrækt áður en staðfestingarpróf er gert. Algengar frekari rannsóknir eru Gram-litun ásamt IMViC-hvörfum til bráðabirgðagreiningar á E. coli og kólígerlum, TSI eða KIA og örverusértæk lífefnafræðileg prófasöfn fyrir þarmabakteríur, með sermifræðilegri greiningu, MALDI TOF eða annarri fullgiltri greiningaraðferð þegar verkefnið krefst þess. Til að fá bakgrunn um hlutverk EMB meðal val- og aðgreiningaræta fyrir þarmabakteríur, sjá inngangsefni um ræktunaræti fyrir þarmabakteríur og frekari rannsóknir með Gram-litun. Um tengda spurningu, hvað blá litun á smásjárgleri getur og getur ekki sannað, heldur myndasafn metýlenblárrar litunar athugun og ályktun aðskildum í sama anda.

Skrifaðu athugunina á undan niðurstöðunni. „Dökkar blásvartar þyrpingar með grænum gljáa sem er háður sjónarhorni á Levine EMB eftir 24 klukkustundir, í samræmi við öfluga laktósagerjun“ er lýsing sem stenst faglega skoðun. „E. coli, staðfest“ krefst staðfestingarskrefsins sem skálin ein og sér getur ekki veitt.