Metilena biru dalam riset stroke dan hipoperfusi serebral: apa yang sebenarnya ditunjukkan oleh tiga model

Arteri yang tersumbat, kultur sel yang kekurangan substrat, dan tikus dengan arteri leher yang menyempit mungkin terdengar seperti tiga versi dari satu eksperimen. Kenyataannya tidak demikian. Masing-masing mengajukan pertanyaan yang berbeda, dan metilena biru memberikan jawaban yang berbeda pada masing-masing model. Jika ketiganya dicampuradukkan, literaturnya tampak saling bertentangan. Jika dipisahkan, muncul pola yang jelas, yang sebagian besar ditentukan oleh waktu pemberian.

Pemisahan itulah inti dari tinjauan ini. Tiga model tersebut adalah stroke fokal akut, deprivasi oksigen-glukosa dengan reoksigenasi pada sel yang dikultur, dan hipoperfusi serebral kronis selama berminggu-minggu. Mekanisme yang diusulkan untuk menghubungkan ketiganya bersifat mitokondrial, tetapi hasilnya berbeda karena konteks metabolismenya juga berbeda.

Tiga model menjawab pertanyaan yang berbeda

Stroke fokal akut pada tikus biasanya dibuat dengan mengoklusi arteri serebri media, disingkat MCAO. Sumbatan menyerupai bekuan menciptakan inti iskemik yang dikelilingi penumbra, yaitu jaringan yang terancam tetapi berpotensi diselamatkan jika aliran darah kembali. Pertanyaannya di sini adalah apakah suatu intervensi memperlambat pertumbuhan infark atau mempertahankan fungsi di sekitar reperfusi.

Deprivasi oksigen-glukosa, disingkat OGD, bekerja pada skala yang berlawanan. Sel otak yang dikultur ditempatkan dalam kondisi oksigen hampir nol tanpa glukosa, lalu dikembalikan ke medium normal. Tidak ada bekuan, sirkulasi kolateral, tekanan darah, maupun sistem imun. Pertanyaannya murni bersifat seluler: apa yang terjadi pada respirasi, ATP, dan kelangsungan hidup ketika substrat menghilang lalu kembali.

Hipoperfusi serebral kronis menggunakan oklusi karotis bilateral permanen pada tikus, yang disebut model 2VO. Aliran darah ke otak depan menurun dan tetap rendah selama berminggu-minggu. Tidak ada infark fokal mendadak dan tidak ada reperfusi darurat. Pertanyaannya adalah apakah dukungan metabolik selama berminggu-minggu dapat mempertahankan pembuluh darah, mitokondria, dan memori selama aliran darah rendah yang berkepanjangan.

Karena itu, peningkatan memori setelah satu bulan pengobatan dalam model 2VO tidak menyatakan secara langsung bahwa otak manusia dapat diselamatkan selama trombektomi darurat. Perbedaan ini penting karena banyak ringkasan yang terlalu optimistis melewatkannya.

Stroke akut: perlindungan saat reperfusi, penundaan tanpa reperfusi

Hasil akut yang paling jelas berasal dari MCAO sementara dengan reperfusi. Tikus menjalani oklusi selama 60 menit, lalu menerima metilena biru dosis rendah secara intravena mulai saat reperfusi, dengan dosis tambahan pada 3 jam dan hari ke-2. MRI menunjukkan lesi kelompok vehicle bertambah sekitar 19 persen pada hari ke-2, sedangkan lesi kelompok yang mendapat perlakuan menyusut sekitar 17 persen, dengan infark akhir sekitar 30 persen lebih kecil dan skor neurologis yang lebih baik pada hari ke-2 dan ke-7. Kelangsungan hidup jaringan inti maupun penumbra pada pencitraan juga membaik. Literatur neuroproteksi yang lebih luas menempatkan perlindungan yang diberikan pada waktu reperfusi ini bersama temuan pada iskemia global dan trauma.

Gambarannya berubah ketika arteri tetap tersumbat. Dalam eksperimen MCAO permanen, metilena biru yang diberikan selama iskemia masih berlangsung memperlambat perluasan lesi difusi dan untuk sementara memperpanjang perfusion-diffusion mismatch, dengan aliran lokal yang sedikit lebih baik, tetapi volume infark akhir pada 24 jam tidak berbeda secara signifikan. Perlakuan ini menunda perubahan jaringan berisiko menjadi infark tanpa menggantikan kebutuhan untuk membuka kembali pembuluh darah.

Studi akut ketiga menambahkan nuansa mengenai mekanisme dan dosis. Satu dosis intraperitoneal segera setelah oklusi menunjukkan penurunan infark terbesar, sekitar 50 persen, pada dosis menengah 5 mg/kg, bukan pada 1 atau 10 mg/kg, disertai skor sensorimotor yang lebih baik. Para penulis mengaitkannya dengan struktur mitokondria yang lebih terjaga dan peningkatan mitofagi, yaitu pembuangan selektif mitokondria yang rusak. Karena itu, dosis, rute, dan jadwal pemberian berpengaruh, dan nilai mg/kg pada tikus bukanlah dosis stroke untuk manusia.

Kultur sel: obat yang sama dapat membantu atau merugikan bergantung pada waktu pemberiannya

Eksperimen astrosit adalah yang paling informatif sekaligus paling sering dikutip secara keliru. Astrosit kortikal primer dari mencit menjalani 6 jam deprivasi berat pada oksigen 0.1 persen dalam medium tanpa glukosa, piruvat, atau serum, diikuti 24 jam reoksigenasi dengan substrat dipulihkan. Sekitar separuh sel mati, sehingga pengujian ini memiliki ruang untuk menunjukkan efek ke arah mana pun.

Ketika metilena biru ada selama fase deprivasi, kelangsungan hidup memburuk, bukan membaik. Ketika diberikan pada saat reoksigenasi, konsentrasi mikromolar rendah meningkatkan viabilitas serta meningkatkan konsumsi oksigen, pengambilan glukosa, dan produksi ATP. Dalam kondisi normal, konsentrasi yang sama meningkatkan pengambilan glukosa sekitar 89 persen pada 0.1 mikromolar dan sekitar 200 persen pada 1 mikromolar, dengan glikogen dan aktivitas heksokinase tetap terjaga setelah cedera serta tanpa peningkatan superoksida yang terukur.

Mekanismenya lebih mudah dipahami melalui analogi generator cadangan. Metilena biru bertindak sebagai pembawa elektron alternatif yang menerima ekuivalen pereduksi dan meneruskannya menuju sitokrom c dan kompleks IV, yang mendukung aliran elektron dan sintesis ATP sekaligus mengurangi kebocoran elektron di bagian hulu. Selama deprivasi berat, stimulasi tersebut menjadi kerugian karena meningkatkan kebutuhan metabolik ketika oksigen dan glukosa hampir tidak tersedia, sehingga cadangan terakhir dapat terkuras lebih cepat. Setelah substrat kembali, sifat yang sama menjadi keuntungan karena membantu mitokondria yang rusak menggunakan oksigen dan glukosa yang telah pulih secara efisien. Itu pula sebabnya temuan dari penjelasan tentang transfer elektron mitokondria perlu selalu disertai konteks deprivasi.

Satu catatan penting: aturan waktu pemberian ini berlaku pada preparasi astrosit tersebut. Studi sel pendamping dengan jenis sel berbeda, deprivasi yang lebih ringan, dan konsentrasi yang lebih rendah menemukan perlindungan bahkan ketika paparan terjadi selama deprivasi. Jenis sel, sisa oksigen, konsentrasi, dan protokol menentukan arah efeknya.

Aliran darah rendah kronis: memori, sitokrom oksidase, dan pembuluh darah selama berminggu-minggu

Eksperimen kronis menggunakan perlakuan dosis rendah setiap hari selama berminggu-minggu, bukan satu bolus darurat. Dalam studi pertama, tikus dengan oklusi karotis permanen menerima 4 mg/kg setiap hari selama satu bulan, diberikan setelah setiap sesi latihan harian untuk menargetkan konsolidasi, bukan performa akut. Hewan dengan oklusi mempelajari tugas diskriminasi visual lebih lambat dan menunjukkan performa yang lebih buruk pada uji memori yang sulit, sedangkan kemampuan berenang, aktivitas motorik, dan pengenalan bau tidak terpengaruh. Perlakuan harian mengurangi defisit pembelajaran dan memori tanpa mengubah perilaku motorik umum.

Studi lanjutan memetakan sitokrom oksidase, yaitu kompleks IV mitokondria, di 44 wilayah otak setelah regimen satu bulan yang sama. Oklusi menurunkan aktivitas enzim di korteks visual, prefrontal, dan perirhinal serta di hipokampus dan amigdala, sekaligus melemahkan aktivitas terkoordinasi antara korteks visual dan hipokampus. Perlakuan mempertahankan aktivitas enzim regional dan memperkuat korelasi metabolik antardaerah tersebut, dan aktivitas yang terjaga berkorelasi dengan performa tugas yang lebih baik. Korelasi ini menggambarkan koordinasi aktivitas enzim metabolik, bukan pengukuran langsung konektivitas fungsional pada manusia, suatu perbedaan yang dibantu diperjelas oleh tinjauan metabolisme energi otak.

Studi terpisah selama satu minggu menggunakan 2 mg/kg setiap hari dan menambahkan inhibitor jalur untuk menguji mekanismenya. Aliran darah serebral meningkat dari sekitar 60 menjadi sekitar 100 mL per 100 g per menit dengan perlakuan, dan kepadatan vaskular hipokampus meningkat dari sekitar 15.1 menjadi 23 persen. Kedua peningkatan tersebut sebagian berbalik ketika jalur survival PI3K/Akt diblokir, dan Akt terfosforilasi meningkat dengan perlakuan. Temuan mengenai aliran darah, kepadatan vaskular, barrier, dan neuron menunjukkan perlindungan neurovaskular yang terkait dengan pensinyalan PI3K/Akt, bukan sekadar efek metabolik.

Mengapa semua ini tidak sama dengan perawatan stroke darurat

Kontrol dalam laboratorium adalah alasan hasil-hasil ini tidak dapat diterapkan secara langsung. Sel yang dikultur tidak memiliki trombus atau farmakokinetik. Model 2VO adalah aliran darah rendah global yang berkepanjangan, bukan embolus fokal mendadak dengan penumbra yang baru terbentuk beberapa menit sebelumnya. Bahkan MCAO pada tikus menggunakan hewan muda yang sehat, anestesi, oklusi yang seragam, dan waktu pemberian dosis yang presisi, tidak seperti pasien yang lebih tua dengan variasi bekuan, aterosklerosis, hipertensi, diabetes, dan waktu onset yang tidak diketahui.

Belum ada uji acak terpublikasi pada manusia yang menetapkan metilena biru sebagai terapi darurat untuk stroke iskemik akut. Sebuah studi pencitraan manusia yang kadang dikutip melibatkan 26 orang dewasa sehat, bukan pasien stroke, dan satu dosis oral mengubah sinyal otak terkait tugas dengan sedikit peningkatan pada pengambilan kembali informasi. Hal itu menunjukkan aktivitas pada sistem saraf pusat, bukan efikasi terhadap stroke. Panduan darurat saat ini berfokus pada reperfusi cepat melalui trombolisis intravena pada pasien yang memenuhi syarat dan trombektomi untuk oklusi pembuluh besar yang sesuai, dan jalur penanganan stroke darurat standar tetap menjadi satu-satunya pendekatan yang terbukti. Penanganan dugaan stroke tidak boleh ditunda untuk memberikan metilena biru, dan keterbatasan praktis ekstrapolasi dosis praklinis menjelaskan mengapa jadwal pada tikus tidak dapat dibaca sebagai regimen klinis.

Konteks keselamatan semakin mempertegas batas tersebut. Metilena biru intravena memiliki boxed warning untuk sindrom serotonin yang serius atau fatal bila dikombinasikan dengan obat serotonergik termasuk SSRI, SNRI, dan inhibitor MAO, yang digunakan oleh banyak pasien dalam kelompok usia stroke. Obat ini dikontraindikasikan pada defisiensi G6PD karena risiko hemolisis. Metilena biru juga menghambat pensinyalan nitric oxide, yang meningkatkan resistensi vaskular dan tekanan dalam beberapa kondisi, sehingga tidak tepat digambarkan secara sederhana sebagai obat yang meningkatkan aliran darah otak. Regimen intravena 1 mg/kg yang disetujui untuk methemoglobinemia didapat bukanlah regimen untuk stroke.

Ringkasan yang tepat bersifat terbatas tetapi nyata. Di sekitar reperfusi pada iskemia fokal sementara, metilena biru dosis rendah mengurangi perkembangan lesi pada tikus. Dalam oklusi permanen, obat ini menunda tetapi tidak mencegah infark. Pada astrosit, obat ini merugikan selama deprivasi berat dan membantu saat reoksigenasi. Selama hipoperfusi kronis, obat ini mempertahankan sitokrom oksidase, pembuluh darah, dan memori selama berminggu-minggu. Satu shuttle, tiga konteks, tiga jawaban.