Biru metilena dan Bartonella: temuan laboratorium dan batas bukti klinis

Cawan kultur dan pasien sama-sama berkaitan dengan satu kata, infeksi, tetapi bukan dengan konsep yang sama. Di dalam cawan, infeksi adalah hitungan koloni pada agar. Pada pasien, infeksi berarti bakteri di dalam sel dan pembuluh darah, obat yang bergerak melalui darah dan jaringan, serta sistem imun yang melakukan sebagian pekerjaan. Jika keduanya disamakan, angka laboratorium yang mencolok mulai terlihat seperti pengobatan. Jika keduanya dipisahkan, angka yang sama kembali menjadi sebagaimana mestinya: alasan untuk melakukan eksperimen berikutnya.

Pemisahan itulah inti seluruh tinjauan tentang biru metilena dan Bartonella ini. Dua studi laboratorium dari satu kelompok penelitian menguji biru metilena terhadap Bartonella henselae dalam keadaan tidak tumbuh. Keduanya melaporkan aktivitas kuat pada wadah kaca dan plastik. Tidak satu pun mengujinya pada manusia.

Mengapa peneliti menguji fase stasioner

Sebagian besar pengujian antibiotik menggunakan sel yang sedang tumbuh. Model tersebut melewatkan kasus yang lebih sulit: sel yang telah berhenti membelah dan menoleransi obat yang membunuh sel sejenis yang sedang tumbuh.

Bartonella dapat bertahan di dalam tubuh, termasuk di dalam eritrosit dan sel endotel. Karena itu, kelompok tersebut menanyakan obat yang telah disetujui mana yang dapat membunuh B. henselae setelah memasuki fase stasioner. MIC rendah terhadap sel yang sedang tumbuh tidak memprediksi kemampuan membunuh pada fase stasioner. Rifampin memiliki MIC yang sangat rendah tetapi membunuh sel stasioner dengan buruk, sedangkan senyawa dengan nilai MIC lebih tinggi justru membunuhnya dengan baik. Pembaca yang menginginkan metode umum untuk membaca jenis makalah seperti ini dapat menemukannya dalam panduan membaca penelitian biru metilena.

Skrining pertama: Li dan kolega, 2019

Skrining fase stasioner tahun 2019 di Antibiotics menggunakan satu galur, B. henselae JK53, yang ditumbuhkan dalam medium Schneider dengan 10 persen serum janin sapi pada 37 C dengan 5 persen CO2. Kultur satu hari sebagian besar terdiri atas sel membelah yang tersebar. Kultur lima hari, pada sekitar 10 pangkat 8 colony forming units per mL, dianggap sebagai fase stasioner dan mengandung agregat yang terlihat.

Uji tersebut menggunakan SYBR Green I dengan propidium iodide, yang dikalibrasi terhadap campuran sel hidup dan sel yang dimatikan dengan isopropanol. Karena biru metilena memiliki warna yang kuat, temuan awal dikonfirmasi melalui mikroskopi lalu melalui hitungan koloni pada agar darah, yaitu titik akhir yang lebih ketat.

Dari 1,581 obat yang telah disetujui pada 50 micromolar, biru metilena menyisakan viabilitas 16 persen menurut pembaca pelat dan 25 persen menurut mikroskopi. Daptomycin mencatat 21 persen, beberapa azole 22 hingga 27 persen, gentamicin 32 persen, erythromycin 66 persen, ciprofloxacin 74 persen. Pyrvinium pamoate tampak lebih kuat pada pembaca pelat tetapi tidak dapat dinilai dengan mikroskopi karena fluoresensinya sendiri.

Terhadap B. henselae yang sedang tumbuh, MIC biru metilena adalah 0.08 hingga 0.16 micrograms per mL. Terhadap sel stasioner berumur lima hari pada 5 micrograms per mL, hitungan koloni turun hingga tidak ada koloni yang terdeteksi setelah satu hari paparan, sebanding dengan daptomycin dan pyrvinium pamoate pada konsentrasi yang diuji. Pengujian time-kill terpisah menggunakan 10 micrograms per mL. Itu adalah tingkat paparan laboratorium, bukan dosis, dan makalah tersebut menyatakannya demikian. Nilai puncak plasma manusia yang dikutip, sekitar 3.9 micrograms per mL, muncul dalam makalah hanya sebagai konteks latar belakang. Tinjauan farmakokinetik biru metilena menjelaskan mengapa angka plasma tidak dapat dibaca sebagai angka jaringan.

Dua keterbatasan dinyatakan secara eksplisit dalam makalah tersebut. Tidak ada model biofilm dan tidak ada pengujian kombinasi biru metilena. Agregat berumur lima hari tersebut merupakan kelompok sel dalam kultur cair stasioner, bukan eksperimen biofilm yang tervalidasi. Para penulis menyerukan penelitian pada hewan, penelitian kombinasi, penelitian biofilm, dan pengujian pada spesies Bartonella lain.

Kombinasi dan sel yang berasal dari biofilm: Zheng dan kolega, 2020

Studi lanjutan tahun 2020 di BMC Microbiology mempertahankan galur dan medium yang sama tetapi beralih ke kultur stasioner enam hari dan menambahkan dua hal yang tidak ada pada makalah pertama: kombinasi dua obat dan model sel yang berasal dari biofilm.

Untuk obat tunggal pada konsentrasi seragam 5 micrograms per mL selama 24 jam, biru metilena menyisakan 3.2 kali 10 pangkat 4 colony forming units per mL dibandingkan kontrol sekitar 2.8 kali 10 pangkat 10. Ciprofloxacin, gentamicin, dan nitrofurantoin menyisakan lebih sedikit koloni pada titik waktu yang sama. Hasil ini berbeda dari hasil tahun 2019, ketika tingkat nominal yang sama menghasilkan tidak adanya koloni yang terdeteksi setelah satu hari. Usia kultur, kepadatan, dan penanganannya berbeda, sehingga efek membunuh dapat direproduksi dari segi arah tetapi tidak identik dari segi besarnya. Pergeseran antar-pengujian ini merupakan salah satu alasan pemeriksaan standar terhadap keamanan dan interaksi memperlakukan potensi laboratorium sebagai hal yang terpisah dari efek klinis.

Skrining kombinasi adalah bagian yang paling sering dikutip. Setiap komponen ditetapkan pada 5 micrograms per mL. Baik azithromycin plus biru metilena maupun rifampin plus biru metilena menghasilkan tidak adanya koloni fase stasioner yang terdeteksi pada 24 jam, begitu pula kedua pasangan ciprofloxacin, dan hanya empat pasangan tersebut dari 25 pasangan yang diuji. Tidak dilakukan analisis sinergi formal, sehingga istilah yang tepat adalah kombinasi aktif dalam kondisi ini, bukan sinergi yang telah terbukti.

Eksperimen biofilm menguji sel yang diperoleh dari biofilm muda yang telah dihancurkan, bukan penetrasi ke dalam biofilm matang yang utuh. Kultur ditumbuhkan selama lima hari, diencerkan ke dalam pelat sumur selama lima hari lagi, dikonfirmasi dengan pewarnaan crystal violet, lalu dikerok sebelum paparan obat. Pada 5 micrograms per mL, biru metilena saja turun menjadi 2.3 kali 10 pangkat 2 pada hari ke-6, termasuk salah satu agen tunggal dengan hasil terbaik, tetapi tidak menjadi nol. Kedua kombinasi biru metilena mencapai nol pada hari ke-6, demikian juga kedua kombinasi ciprofloxacin.

Para penulis menandai keterbatasan yang sama yang juga akan diperhatikan pembaca yang cermat: biofilm muda yang dikerok alih-alih biofilm tua yang utuh, satu konsentrasi praktis untuk semua obat alih-alih setiap obat pada puncak realistisnya masing-masing, hanya pasangan terpilih yang berpusat pada azithromycin atau rifampin, satu galur, tanpa hewan, tanpa pasien. Penelitian tiga obat selanjutnya diusulkan, bukan dilaporkan.

Perbandingan desain studi

Tabel tersebut merangkum inti artikel ini. Semua yang berada di sebelah kiri kolom terakhir adalah penelitian kultur. Tidak ada bagian dari kedua makalah tersebut yang mengisi kolom terakhir.

Bartonella bukan Borrelia

Kedua makalah menyebut Borrelia burgdorferi, spiroketa penyakit Lyme, karena uji pewarna berasal dari penelitian fase stasioner Borrelia sebelumnya di laboratorium yang sama, tempat biru metilena dan daptomycin juga teridentifikasi sebagai temuan aktif. Riwayat ini merupakan konteks yang berguna sekaligus sumber kesalahan yang umum.

Tidak ada eksperimen dalam kedua makalah Bartonella yang menguji Borrelia berdampingan dengan Bartonella. Organismenya berbeda, mediumnya berbeda, konsentrasinya berbeda, dan efek membran biru metilena pada Bartonella yang dihipotesiskan dinyatakan sebagai spekulasi yang memerlukan penelitian lebih lanjut. Hasil tidak boleh dipindahkan begitu saja antarspesies, dan tidak satu pun makalah mendukung klaim luas tentang parasit. Perbandingan persister Borrelia dan Bartonella memisahkan kedua literatur tersebut karena alasan ini.

Mengapa hasil kultur tidak dapat diubah menjadi sebuah protokol

Minat pencarian terhadap protokol biru metilena untuk bartonella dapat dipahami. Makalah-makalah inilah alasan frasa tersebut sebaiknya diperlakukan sebagai tanda peringatan, bukan daftar belanja.

Pertama, 5 micrograms per mL dalam sebuah sumur bukanlah resep. Angka tersebut tidak mencakup absorpsi, distribusi, pengikatan protein, penetrasi intraseluler, atau tolerabilitas. Para penulis memilihnya sebagai perkiraan rata-rata puncak antibiotik dan menyatakan bahwa penelitian selanjutnya seharusnya menggunakan setiap obat pada tingkat realistisnya masing-masing.

Kedua, nol koloni berarti tidak ada koloni dalam kondisi penanaman tersebut, bukan jaringan yang steril. Persister, bakteri intraseluler, dan keterbatasan pengambilan sampel semuanya berada di luar cakupan pelat agar.

Ketiga, kombinasi yang mensterilkan sebuah sumur dapat gagal atau menimbulkan bahaya di dalam tubuh. Azithromycin plus biru metilena dan rifampin plus biru metilena adalah pasangan laboratorium pada tingkat paparan laboratorium. Tanpa farmakokinetik pada hewan dan data manusia terkontrol, tidak ada dosis, tidak ada durasi, dan tidak ada rasio manfaat terhadap risiko. Siapa pun yang mempertimbangkan pilihan sebaiknya mendiskusikannya dengan klinisi dan meninjau kapan penggunaan biru metilena memerlukan pengawasan medis sebelum menarik kesimpulan apa pun dari data cawan.

Kesimpulan terbatas yang memang didukung oleh makalah-makalah ini adalah sebagai berikut: biru metilena memiliki aktivitas yang dapat direproduksi terhadap B. henselae JK53 yang tidak tumbuh secara in vitro, termasuk dalam kombinasi dua obat di laboratorium, dengan hasil kombinasi dan sel yang berasal dari biofilm terkuat berasal dari studi tahun 2020. Segala hal lainnya, termasuk apakah aktivitas tersebut relevan bagi bartonellosis pada manusia, masih belum diuji.