ATP dan metilen biru: apakah penggunaan oksigen yang lebih tinggi berarti lebih banyak energi?

Sebuah mitokondria terisolasi berada di dalam ruang dengan bahan bakar tetapi tanpa ADP. Mitokondria itu mengonsumsi oksigen secara perlahan. Tambahkan ADP dan konsumsi oksigen melonjak beberapa kali lipat. Tunggu hingga ADP habis dan konsumsi oksigen kembali turun. Bahan bakarnya tidak pernah berubah. Yang berubah hanyalah kebutuhan akan ATP.

Urutan singkat itu mencakup seluruh perbedaan yang dibahas dalam artikel ini. Konsumsi oksigen mengukur seberapa cepat elektron mengalir melalui rantai respirasi menuju oksigen. Produksi ATP mengukur seberapa banyak aliran tersebut yang ditangkap sebagai energi yang dapat digunakan. Keduanya berbagi satu tahap perantara, yaitu gradien proton melintasi membran dalam mitokondria, dan apa pun yang mengubah seberapa erat gradien tersebut dikopel dengan sintesis ATP dapat membuat kedua titik akhir bergerak ke arah yang berbeda. Metilen biru berguna untuk memahami hal ini karena telah diamati melakukan keduanya: meningkatkan penggunaan oksigen bersamaan dengan ATP pada beberapa preparasi, dan meningkatkan penggunaan oksigen sementara ATP tetap datar atau menurun pada preparasi lainnya.

Pembaca yang ingin memahami gambaran mekanisme pemindahan elektron yang lebih luas terlebih dahulu dapat memulai dengan bagaimana metilen biru memindahkan elektron melalui rantai respirasi, sedangkan pembaca yang ingin memahami istilah dalam eksperimen oksigen awal dapat membaca apa yang sebenarnya ditunjukkan oleh pengukuran respirasi pertama.

Respirasi, ATP, dan gradien di antara keduanya

Elektron dari NADH dan FADH2 memasuki rantai pada kompleks I dan II, melewati kompleks III menuju sitokrom c, lalu melalui kompleks IV menuju oksigen. Energi yang dilepaskan pada kompleks I, III, dan IV memompa proton keluar dari matriks menuju ruang antarmembran. Pemisahan muatan dan keasaman tersebut merupakan gaya gerak proton, dan komponen listriknya, yaitu potensial membran, biasanya merupakan bagian yang dominan.

ATP sintase memungkinkan proton mengalir kembali ke dalam matriks dan menggunakan energi yang dilepaskan untuk menggabungkan ADP dan fosfat menjadi ATP. Jadi rantainya adalah:

konsumsi oksigen, lalu pemompaan proton, lalu gradien, lalu sintesis ATP.

Masalahnya, proton dapat kembali melalui jalur lain. Setiap aliran kembali yang melewati ATP sintase disebut kebocoran proton. Kebocoran memaksa rantai untuk memompa proton yang sama lagi agar potensial membran tetap stabil, sehingga mengonsumsi lebih banyak oksigen tanpa menghasilkan lebih banyak ATP. Kebocoran yang cukup kuat merupakan uncoupling: penggunaan oksigen meningkat sementara ATP tetap datar atau menurun, dan energi yang terbuang dilepaskan sebagai panas.

State 3, state 4, dan rasio kontrol respirasi

Istilah klasik untuk hal ini berasal dari mitokondria terisolasi. State 3 adalah respirasi ketika substrat dan ADP tersedia: ATP sintase menguras gradien, potensial membran menurun, rantai mempercepat aktivitasnya untuk membangun kembali gradien, dan penggunaan oksigen tinggi karena ATP sedang diproduksi. State 4 adalah respirasi setelah ADP habis: ATP sintase hampir tidak bekerja, gradien meningkat, potensial membran yang tinggi menahan pemompaan lebih lanjut, dan penggunaan oksigen turun hingga tingkat yang diperlukan untuk mengompensasi kebocoran.

Karena itu, rasio kontrol respirasi, yaitu state 3 dibagi state 4, menunjukkan seberapa erat preparasi tersebut dikopel. Rasio yang tinggi berarti ADP mengendalikan respirasi dengan kuat. Rasio yang menurun disertai kenaikan state 4 berarti kebocoran mulai mendominasi. Inilah kerangka yang membuat hasil metilen biru di bawah ini masuk akal.

Satu model mental penting untuk diingat. Potensial membran yang tinggi memperlambat rantai. Menghilangkan potensial tersebut mempercepatnya. Rantai merespons seberapa sulit proses pemompaan berlangsung, bukan secara langsung apakah ATP sedang diproduksi.

Ketika kedua titik akhir bergerak bersama

Contoh kopling yang paling jelas berasal dari mitokondria otak marmut terisolasi dengan kompleks respirasi yang diblokir. Pada 100 nanomolar hingga 1 micromolar metilen biru, konsumsi oksigen saat istirahat meningkat ketika glutamat plus malat, suksinat, atau gliserofosfat digunakan sebagai bahan bakar, sementara respirasi yang distimulasi ADP tidak berubah. Pada mitokondria yang diracuni pada kompleks I atau kompleks III, zat pewarna tersebut sedikit meningkatkan produksi ATP, memulihkan potensial membran, dan meningkatkan pengambilan kalsium. Jalur yang diusulkan adalah sebuah jalan pintas: zat pewarna menerima elektron di sisi hulu dari blokade dan menyerahkannya kepada sitokrom c, sehingga melewati kompleks yang rusak.

Kasus kedua dengan kopling menggunakan sumber ATP yang sama sekali berbeda. Pada mitokondria otak terisolasi dengan ATP sintase yang dihambat, metilen biru tetap merangsang respirasi pada setiap substrat yang diuji. Namun sintesis ATP meningkat hanya pada alfa ketoglutarat dan glutamat, dua substrat yang membentuk suksinil CoA. Dengan oligomisin menghambat ATP sintase, ATP tambahan berasal dari fosforilasi tingkat substrat oleh suksinil CoA ligase dalam siklus asam sitrat, bukan dari fosforilasi oksidatif. Zat pewarna tersebut juga memulihkan potensial membran ketika kompleks I dan ATP sintase dihambat secara bersamaan. Di sini penggunaan oksigen dan ATP bergerak bersama, tetapi hanya ketika substrat memungkinkan jalur ATP kedua tersebut. Pada suksinat atau malat, respirasi meningkat tanpa ATP tambahan. Zat pewarna yang sama, ruang yang sama, bahan bakar berbeda, hasil berbeda.

Ketika kedua titik akhir menyimpang

Kasus penyimpangan juga telah dipublikasikan dan sama pentingnya untuk dipahami. Dalam sebuah studi mitokondria hati tikus terisolasi dari 1997, metilen biru mempercepat respirasi state 4 pada mitokondria yang menggunakan suksinat dan memiliki kopling erat, sehingga menurunkan rasio kontrol respirasi. Efek tersebut terlihat mulai dari 0.5 micromolar dan kuat pada 5 micromolar, konsentrasi yang mendekati kadar plasma setelah bolus intravena 100 milligram. Pada 5 micromolar mitokondria juga membengkak, meskipun gangguan kopling muncul terlebih dahulu pada konsentrasi yang lebih rendah, yang menunjukkan bahwa kebocoran terjadi sebelum kerusakan struktural dan bukan disebabkan olehnya. Pada mitokondria yang mengalami uncoupling, zat pewarna merangsang respirasi secara jenuh dan bergantung pada konsentrasi. Penggunaan oksigen meningkat pada kedua preparasi. Sintesis ATP per oksigen yang dikonsumsi tidak meningkat. Ini adalah contoh klasik uncoupling plus pemindahan elektron dalam molekul yang sama.

Pemisahan paling mencolok berasal dari retina. Pada tikus dengan defisiensi AIF dan sel fotoreseptor yang diberi rotenon, metilen biru mempertahankan ketebalan retina, penanda fotoreseptor, dan struktur mitokondria, serta menurunkan rasio NADH terhadap NAD dan meredam jalur stres termasuk respons protein tidak terlipat dan mitofagi. Efek tersebut terjadi tanpa memperbaiki kekurangan ATP. Perlindungan tanpa pemulihan energi berarti manfaatnya berjalan melalui keseimbangan redoks dan integritas mitokondria, bukan melalui ATP tambahan. Menyamakan kelangsungan jaringan dengan pemulihan keluaran energi akan menghasilkan pembacaan yang sepenuhnya keliru terhadap eksperimen tersebut.

Penelitian pada mitokondria otak juga menambahkan sisi biaya pada perhitungan yang sama. Konsentrasi rendah yang sama yang meningkatkan bioenergetika juga meningkatkan pembentukan hidrogen peroksida dalam setiap kondisi yang diuji dan memperlambat eliminasinya, yang diukur menggunakan uji Amplex terkalibrasi, bukan zat pewarna nonspesifik. Lebih banyak ATP dan lebih banyak oksidan muncul sebagai satu pasangan.

Daftar periksa praktis untuk membaca hasil

Empat pertanyaan membedakan hasil yang terkopel dari hasil yang mengalami uncoupling.

Pertama, titik akhir apa yang sebenarnya diukur. Konsumsi oksigen saja tidak dapat menunjukkan ATP. Sintesis ATP, potensial membran, dan rasio kontrol respirasi masing-masing menambahkan satu informasi yang tidak dapat dilihat oleh elektroda oksigen. Panduan untuk membaca klaim penelitian metilen biru membahas disiplin dalam menilai titik akhir ini secara terperinci.

Kedua, substrat apa yang memasok mitokondria. Hasil suksinil CoA menunjukkan bahwa pilihan bahan bakar dapat menentukan apakah respirasi tambahan dapat menjadi ATP tambahan sama sekali.

Ketiga, konsentrasi apa yang digunakan. Metilen biru pada konsentrasi nanomolar hingga micromolar rendah dalam mitokondria otak menghasilkan peningkatan bioenergetika yang moderat dengan biaya berupa oksidan; setengah micromolar dan lebih tinggi dalam mitokondria hati mengurangi kopling; 5 micromolar juga menyebabkan pembengkakan. Konsentrasi merupakan bagian dari mekanisme, bukan detail latar belakang.

Keempat, model apa yang menghasilkan temuan tersebut. Mitokondria terisolasi memperlihatkan mekanismenya, tetapi sel dan jaringan utuh menambahkan transportasi, reduksi menjadi bentuk tidak berwarna, dan berbagai jalur lain yang bersaing menerima elektron. Penelitian dosis laboratorium, termasuk bagaimana konsentrasi dan protokol membentuk efek metilen biru, merupakan jembatan antara angka dari ruang eksperimen dan klaim apa pun tentang seseorang.

Konsumsi oksigen menunjukkan aliran elektron. ATP menunjukkan seberapa banyak aliran tersebut yang ditangkap. Metilen biru dapat mengubah salah satunya, dan eksperimen di atas menunjukkan keempat kombinasi yang dapat terjadi: keduanya meningkat, respirasi meningkat hanya ketika substrat memungkinkan, respirasi meningkat sementara kopling menurun, dan jaringan dipertahankan sementara ATP tetap datar. Angka pada elektroda oksigen adalah awal dari interpretasi, bukan akhirnya.