Մեթիլենային կապույտը և ցրված սկլերոզը․ ինչ են ուսումնասիրել կենդանիների վրա կատարված հետազոտությունները

Եթե փնտրեք մեթիլենային կապույտի կիրառումը MS-ի դեպքում, կգտնեք հոդվածներ, որոնք կարծես նույն հարցին են պատասխանում։ Բայց այդպես չէ։ Մի հետազոտության մեջ հիվանդ մկներին մեթիլենային կապույտ են տվել որպես բուժում։ Մյուսում դրանով ոչ մի կենդանի չեն բուժել։ Այն օգտագործել են որպես կապույտ ներկ ողնուղեղի բարակ կտրվածքների վրա, որպեսզի ախտաբանը կարողանա մանրադիտակով տեսնել միելինը։

Սա ամբողջ հոդվածի առանցքային գաղափարն է։ Կենսաբանության մեջ այս ներկը երկու դեր ունի, որոնց միակ ընդհանրությունը շիշն է։ Որպես հնարավոր դեղամիջոց՝ այն որոշակի դեղաչափով ներմուծվում է կենդանի օրգանիզմ, և հարցն այն է, թե արդյոք հիվանդությունը փոխվում է։ Որպես ներկ՝ այն փորձից հետո կիրառվում է մեռած, ֆիքսված հյուսվածքի վրա, և հարցն այն է, թե ինչ տեսք ուներ հյուսվածքը։ Եթե բաց թողնեք այս տարբերությունը, ախտաբանական հետազոտության մեթոդների բաժինը կկարդաք այնպես, կարծես այն բուժման արդյունք է ներկայացնում։

Ի՞նչ է EAE-ն՝ պարզ բառերով

Փորձարարական աուտոիմուն էնցեֆալոմիելիտը, որը սովորաբար կրճատվում է EAE, ցրված սկլերոզի որոշ կողմերի ուսումնասիրման ստանդարտ կենդանական մոդելն է։ Հետազոտողը նախատրամադրված մկանը իմունացնում է միելինային սպիտակուցի հատվածով՝ ուժեղ ադյուվանտի հետ միասին։ Այնուհետև իմունային համակարգը հարձակվում է կենդանու սեփական կենտրոնական նյարդային համակարգի վրա։ Մկան մոտ զարգանում է վերընթաց թուլություն, որը հեշտ է գնահատել 0-ից 5 սանդղակով՝ թուլացած պոչից մինչև հետին վերջույթների կաթված։

Գնահատման այս հարմարությունը բացատրում է թե՛ EAE-ի տարածվածությունը, թե՛ դրա մոլորեցնող կողմը։ Մարդկանց մոտ MS-ն առաջանում է ինքնաբուխ, ներառում է թիրախների ավելի լայն և պակաս հստակ սահմանված շրջանակ ու առաջացնում տեսողական, զգայական, ճանաչողական, ուղեղիկային և շարժողական ախտանիշներ՝ կրկնվող կամ առաջադիմող ընթացքով։ EAE-ն վերահսկվող պայմաններում վերարտադրում է առանձին մեխանիզմներ, օրինակ՝ բորբոքումը, դեմիելինացումը և աքսոնների վնասումը։ Այն MS-ի փոքրածավալ պատճենը չէ։ Ընդհանուր պատկերացում ցանկացող ընթերցողները կարող են նախ ծանոթանալ բջջային մակարդակում մեթիլենային կապույտի ենթադրվող ազդեցությանը, ապա գնահատել որևէ կոնկրետ հիվանդության վերաբերյալ պնդումը։

Ստորև քննարկվող երկու հետազոտությունները նաև օգտագործել են EAE հարուցող տարբեր հակածիններ, ինչը կարևոր է։ Բուժման ուսումնասիրության մեջ հիվանդությունը հարուցել են MOG35-55-ով՝ միելինային օլիգոդենդրոցիտային գլիկոպրոտեինի կարճ պեպտիդով։ Ախտաբանական ուսումնասիրության մեջ հիվանդությունը հարուցել են MP4-ով՝ միելինի հիմնական սպիտակուցի և պրոտեոլիպիդային սպիտակուցի հատվածների միաձուլմամբ։ Կենդանու գծի և հակածնի ընտրությունը փոխում է վնասման օջախների տեղակայումը և բորբոքման ընթացքը, ուստի այս երկու ուսումնասիրությունները նույն փորձի երկու կրկնություն չեն։

Քարտեզը․ մոդելից դեպի հարց և սահմանափակումներ

Այս աղյուսակը պահեք բաց։ Այն այս հոդվածի հիմնական հղման աղյուսակն է։ Յուրաքանչյուր տող ցույց է տալիս, թե մոդելը որ կլինիկական հարցին կարող է պատասխանել, իրականում ինչ է չափվել և որտեղ է ավարտվում արդյունքները մարդկանց վրա ընդհանրացնելու հնարավորությունը։

Հաջորդ վերնագրի հավաստիությունը ստուգելիս կարելի է կրկին օգտագործել նույն սյունակները՝ օգտվելով նախակլինիկական ուսումնասիրությունները կարդալու ուղեցույցից․ պարզեք կենդանու տեսակը և հակածինը, միացության դերը, վերջնակետերը և այն, թե արդյունքը հիվանդության ընթացք է նկարագրում, թե հյուսվածքի պատկերը մեկ ժամանակակետում։

Բուժման արդյունքը․ ինչ փոխեց դեղի ներմուծումը

Journal of Neuroimmunology-ում հրապարակված 2016 թվականի բուժման ուսումնասիրության մեջ օգտագործել են մոտ 8-ից 10 շաբաթական էգ C57BL/6 մկներ՝ յուրաքանչյուրին իմունացնելով 250 միկրոգրամ MOG35-55-ով։ Հիվանդությունը հարուցելուց հետո EAE ունեցող կենդանիներին պատահականորեն բաշխել են մեթիլենային կապույտ ստացող խմբի կամ չբուժվող EAE խմբի մեջ և կլինիկական գնահատականներին հետևել մինչև մոտավորապես 30-րդ օրը։

15-րդ օրից մինչև 30-րդ օրը բուժված մկների կլինիկական գնահատականները նշանակալիորեն ցածր էին EAE-ի վերահսկիչ խմբի համեմատ՝ P-ն 0.01-ից փոքր։ Ողնուղեղի վերլուծությունն էլ ցույց տվեց նույն ուղղությունը․ բուժված կենդանիների մոտ ավելի քիչ էին բորբոքային ինֆիլտրացիան, դեմիելինացումը և աքսոնների կորուստը։

Ուսումնասիրության առանձնահատուկ մասը ազդանշանային ցուցանիշների խումբն էր։ Բուժումը մեծացրել էր AMPK-ի ակտիվացումը և SIRT1-ի արտահայտումը ու ճնշել NF-kB-ի՝ բորբոքման առանցքային կարգավորիչի ակտիվացումը։ Ձեռքբերովի իմունային համակարգում այն նվազեցրել էր Th17 պատասխանը և ուժեղացրել Treg պատասխանը։ Հետևաբար առաջարկվող շղթան այսպիսին է․ մեթիլենային կապույտից դեպի AMPK և SIRT1, ապա՝ NF-kB-ի ազդանշանման նվազում, բորբոքային Th17-ից դեպի կարգավորիչ Treg տեղաշարժ, հյուսվածքի ավելի թեթև վնասում և ավելի ցածր գնահատականներ։

Այս շղթան մեկնաբանություն է, ոչ թե ապացուցված պատճառահետևանքային հաջորդականություն։ Ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ դեղի կիրառումը, ազդանշանների փոփոխությունները և հիվանդության բարելավումը դիտվել են միասին։ Այն չի ապացուցում, որ ամբողջ օգտակար ազդեցությունն իրականանում է AMPK-ի և SIRT1-ի միջոցով, իսկ հանրայնորեն ինդեքսավորված տեքստում բավականաչափ հստակ չեն նշվում մեկ կիլոգրամի հաշվով միլիգրամներով ճշգրիտ դեղաչափը, ներմուծման ուղին, մեկնարկի օրը կամ տևողությունը, որպեսզի միայն ամփոփագրով հնարավոր լինի վերարտադրել կիրառման սխեման։ Վաճառքի էջում այս հոդվածի վերաբերյալ մեջբերված ցանկացած դեղաչափ համարեք չստուգված, եթե այն չի հղվում ամբողջական տեքստի մեթոդների բաժնին։ Մեթիլենային կապույտի վերաբերյալ մարդկանց մասնակցությամբ հետազոտությունների ավելի լայն ապացուցողական բազան այն տեղն է, որտեղ պետք է ստուգել՝ արդյոք այս վաղ իմունային ազդանշանը հետագայում հաստատվել է կլինիկական տվյալներով։

Ախտաբանական արդյունքը․ ինչ ցույց տվեց հյուսվածքը վեց ամսվա ընթացքում

PLoS ONE-ում հրապարակված 2015 թվականի MP4 ուսումնասիրության մեջ օգտագործել են էգ C57BL/6 մկներ՝ իմունացված 200 միկրոգրամ MP4-ով՝ Ֆրոյնդի ամբողջական ադյուվանտի մեջ, և կապույտ հազի տոքսինով՝ իմունացման օրը և կրկին 48 ժամ անց։ Ոչ մի կենդանի մեթիլենային կապույտ չի ստացել որպես դեղամիջոց։ Ֆիքսումից և ներդրումից հետո ողնուղեղի մեկ միկրոմետր հաստությամբ լայնակի կտրվածքները ներկել են մեթիլենային կապույտով՝ լուսային մանրադիտակով ուսումնասիրելու համար, իսկ ավելի մանրամասն պատկերի համար էլեկտրոնային մանրադիտակով ուսումնասիրել են առաջակողմնային ուղին։

Հյուսվածքի նմուշներ վերցրել են երեք փուլում՝ սուր փուլի գագաթնակետին՝ 7 մկնից, հիվանդության սկզբից երեք ամիս անց՝ 5 մկնից, և սկզբից վեց ամիս անց՝ 10 մկնից։ Այդ փուլերի միջին կլինիկական գնահատականները գրեթե նույնն էին՝ մոտ 1.7-ից 1.8՝ 0-ից 5 սանդղակով։ Հյուսվածքն այլ պատկեր էր ցույց տալիս։ Միայն միելինի վնասումով մանրաթելերի թիվը սուր փուլի գագաթնակետի մոտ 569,000-ից հասել էր մոտ 1,496,000-ի մեկ քառակուսի միլիմետրում՝ վեց ամիս անց․ սուր և երկարաժամկետ փուլերի համեմատությունը վիճակագրորեն նշանակալի էր՝ P-ն հավասար 0.027-ի։ Միելինի և աքսոնի համակցված վնասումը վեց ամսվա ընթացքում մոտավորապես կրկնապատկվել էր։ Վերամիելինացվող մանրաթելերը բոլոր փուլերում մեկ տոկոսից պակաս էին, ինչը զգաստացնող մանրամասն է վերականգնման հույսերի համար։

Աքսոնների վնասումն ուներ U-աձև ընթացք․ բարձր էր սուր փուլի գագաթնակետին, ավելի ցածր՝ երեք ամիս անց, և ամենաբարձր՝ վեց ամիս անց։ Այն կապված էր միտոքոնդրիումների ուռչման և նեյրոֆիլամենտների միջև հեռավորության նվազման հետ։ Գնահատումը կատարվել էր առանց կլինիկական գնահատականն ու փուլն իմանալու, ինչը ամրապնդում է այն մեկնաբանությունը, որ կլինիկական գնահատականները թերագնահատում էին շարունակվող կառուցվածքային վնասումը։

Այս անհամապատասխանությունն է ուսումնասիրության իրական ներդրումը MS-ով հետաքրքրվող ընթերցողի համար։ Ֆունկցիոնալ սահմանափակման կայուն գնահատականը չէր նշանակում հյուսվածքի կայուն վիճակ։ Այն նաև ցույց է տալիս, թե ինչու այս հոդվածը չի կարող հիմնավորել մեթիլենային կապույտով MS-ի բուժման որևէ պնդում։ Այն ուսումնասիրել է ժամանակը, ոչ թե բուժումը։

Ինչու ուսումնասիրություններից ոչ մեկը չի հաստատում օգուտը հիվանդների համար

Յուրաքանչյուր հոդված դիտարկեք որպես նեղ հարցին լավ պատասխանող ուսումնասիրություն, որը հիվանդներին վերաբերող հարցին ընդհանրապես չի պատասխանում։

Նախ՝ պատճառը տարբեր է։ EAE-ն միտումնավոր հարուցվում է սահմանված հակածինով և ադյուվանտով։ Մարդկանց մոտ MS-ն զարգանում է ինքնաբուխ՝ իմունային ավելի լայն մասնակցությամբ, որը ներառում է T բջիջներ, B բջիջներ, բնածին իմունիտետը և տեղային գլիալ բջիջները։ Միացությունը, որը մկան մոտ փոխում է MOG-ին ուղղված պատասխանը, պարտադիր չէ, որ փոխի մարդու այդ ավելի լայն պատասխանը։

Երկրորդ՝ ֆենոտիպը տարբեր է։ Մկան պոչից դեպի հետին վերջույթներ տարածվող վերընթաց թուլությունը հարմար գնահատման ցուցանիշ է։ Այն մարդկանց MS-ի բազմազան դրսևորումները սեղմում է մեկ շարժողական թվային ցուցանիշի մեջ։ Դեղերը հաճախ փոխում են EAE-ի կարճաժամկետ գնահատականները՝ առանց մարդկանց հիվանդության ընթացքը փոխելու, ուստի EAE-ն նախնական ստուգման և մեխանիզմների ուսումնասիրման գործիք է, ոչ թե փոքրածավալ կլինիկա։

Երրորդ՝ ազդեցության չափն ու կիրառման ժամանակը մնում են չպարզված։ Մկների վրա 30 օր տևող փորձի սկզբնական փուլում դեղի շարունակական ներմուծումը նույնը չէ, ինչ արդեն զարգացած հիվանդություն ունեցող մարդու երկարատև բերանային ընդունումը, և ուսումնասիրություններից ոչ մեկում չեն չափել դեղի մակարդակները նյարդային համակարգում։ Առանց այդ կապի հնարավոր չէ լաբորատոր թիթեղում եղած խտությունից կամ մկանը տրված դեղաչափից անցնել մարդու կիրառման սխեմայի։

Չորրորդ՝ երկու հոդվածները չեն կրկնում միմյանց արդյունքները։ Տարբեր հակածիններ, տարբեր հարցեր, տարբեր վերջնակետեր, իսկ մի դեպքում՝ ընդհանրապես ոչ մի բուժում։ Դրանք միասին որպես MS-ի բուժման երկու դրական ուսումնասիրություն մեջբերելը տարբեր կատեգորիաները շփոթելու սխալ է։

Ինչ է սա նշանակում ապացույցները գնահատող ընթերցողների համար

Այս հոդվածներում MS-ի համար մեթիլենային կապույտի հաստատված կիրառման արձանագրություն չկա։ Բուժման ուսումնասիրությունը հիմք է տալիս MOG EAE-ում AMPK-ի, SIRT1-ի, NF-kB-ի և Th17-ի ու Treg-ի հավասարակշռության հետագա հետազոտության համար։ Ախտաբանական ուսումնասիրությունը հիշեցնում է, որ հյուսվածքի վնասումը կարող է առաջադիմել, երբ գնահատականները մնում են անփոփոխ, և որ մեթոդների բաժնում մեթիլենային կապույտի հիշատակումը երբեմն նշանակում է ներկի տարա, ոչ թե դեղամիջոց։ Ցրված սկլերոզի ընթացիկ հետազոտություններին հետևող ընթերցողները պետք է հիշեն ներկի և դեղի այս տարբերությունը։ Անվտանգության հարցերը, ներառյալ արյան հետ կապված և փոխազդեցությունների ռիսկերը, պետք է քննարկվեն բժշկի հետ՝ մեթիլենային կապույտի անվտանգության ընդհանուր տվյալների հետ միասին, նախքան որևէ մեկը գործի անցնի լաբորատոր հետազոտությունների վերնագրերի հիման վրա։

Հիմնական եզրակացությունը տեղավորվում է մեկ նախադասության մեջ։ Մեջբերվող ուսումնասիրություններից մեկում MOG EAE ունեցող մկներին մեթիլենային կապույտ են ներմուծել և հայտնել հիվանդության ավելի թեթև ընթացքի ու հակաբորբոքային իմունային տեղաշարժի մասին, իսկ մյուսում ոչ մի դեղ չեն ներմուծել և մեթիլենային կապույտն օգտագործել են միայն ողնուղեղը ներկելու համար՝ արձանագրելով վեց ամսվա ընթացքում կուտակվող միելինի և աքսոնների վնասումը, ուստի այս երկու ուսումնասիրությունները չեն հաստատում, որ մեթիլենային կապույտն օգնում է մարդկանց MS-ի դեպքում։