Մեթիլենային կապույտը՝ որպես հակաօքսիդանտ և պրոօքսիդանտ․ ի՞նչն է փոխում արդյունքը

Ենթադրենք՝ երկու լաբորատորիա փորձարկում է նույն կապույտ ներկանյութը և հաղորդում հակադիր արդյունքներ։ Առաջինում ուղեղի մեկուսացված միտոքոնդրիումներն ավելի լավ են շնչում և ավելի շատ ATP են արտադրում։ Երկրորդում նույն պատրաստուկն արտազատում է շատ ավելի մեծ քանակությամբ ջրածնի պերօքսիդ։ Երկու հաղորդումներն էլ ճիշտ են։ Դրանք նկարագրում են նույն ցիկլը՝ երկու տարբեր կողմերից, իսկ շփոթությունն սկսվում է այն ժամանակ, երբ ընթերցողները մի կողմն ընդունում են որպես ամբողջ պատկերը։

Սխալը մոլեկուլի համար համապատասխան պիտակ փնտրելն է։ Մեթիլենային կապույտը էլեկտրոնների փոխանցող է, ինչպես ավելի լայն համատեքստում ցույց է տալիս բջջային կենսաբանության մեջ դրա թիրախների քարտեզը։ Օքսիդացված ներկանյութն ընդունում է էլեկտրոններ և վերածվում անգույն leucoMB-ի։ LeucoMB-ն այդ էլեկտրոնները փոխանցում է հաջորդ ընդունողին և կրկին կապույտ է դառնում։ Ձեր դիտարկած արդյունքը կախված է նրանից, թե ով է տալիս էլեկտրոնները, ով է դրանք ընդունում, և արդյոք համակարգը կարող է հեռացնել այդ ընթացքում առաջացած ջրածնի պերօքսիդը։ Արժեքավոր հարցը երբեք այն չէ, թե արդյոք ներկանյութը հակաօքսիդանտ է։ Հարցն այն է, թե տվյալ պայմաններում ինչ կարող է անել այս փոխանցողը։

Երկու դրսևորումն էլ առաջացնող ցիկլը

Մթության մեջ հիմնական ցիկլը կարճ է։ NADH-ը, NADPH-ը կամ շնչառական շղթայի փոխադրիչները վերականգնում են ներկանյութը։ Այնուհետև վերականգնված ներկանյութն ունի մրցակցող ուղիներ։ Այն կարող է էլեկտրոններ փոխանցել ցիտոքրոմ c-ին և ապահովել դրանց հոսքը՝ շրջանցելով վնասված համալիրը։ Այդ պատճառով I կամ III համալիրի արգելափակման պայմաններում շնչառությունն ու թաղանթային պոտենցիալը մասամբ վերականգնվում են։ Կամ այն կարող է էլեկտրոններն անմիջապես փոխանցել թթվածնին, ինչի արդյունքում վերականգնվում է կապույտ ձևը և առաջանում ջրածնի պերօքսիդ։ Քանի որ ներկանյութը վերագեներացվում է, դրա փոքր քանակությունը կարող է այս ցիկլը բազմիցս կրկնել՝ շարունակաբար սպառելով վերականգնող համարժեքներ և շարունակաբար արտադրելով պերօքսիդ։

Եվս երկու ճյուղ ամբողջությամբ փոխում են քիմիական պատկերը։ Ազատ պղինձը կամ երկաթը Ֆենտոնի տիպի ռեակցիաներով այդ դիֆուզվող պերօքսիդը վերածում են շատ ավելի քայքայիչ տեղային օքսիդանտների։ Կարմիր լույսը բացում է առանձին լուսաքիմիական ճյուղ, որտեղ գրգռված ներկանյութը էներգիա է փոխանցում թթվածնին և առաջացնում սինգլետային թթվածին՝ մի տեսակ, որը մանրամասն քննարկվում է I և II տիպերի լուսաքիմիայի բացատրությունում։ Մթության մեջ օքսիդավերականգնման ցիկլը, մետաղներով ուժեղացված վնասումը և ֆոտոդինամիկ վնասումը երեք տարբեր մեխանիզմներ են, որոնք պարզապես ունեն նույն սկզբնական մոլեկուլը։

Պայմանների և արդյունքների մատրիցը

Ստորև բերված աղյուսակն այն նյութն է, որն արժե պահպանել։ Յուրաքանչյուր տողում ներկայացված են մեկ փոփոխական, դրա ազդեցության ուղղությունը և այն հիմնավորող փորձը։ Դրականը նշանակում է պաշտպանական կամ բարելավված ցուցանիշ։ Անբարենպաստը նշանակում է ավելի շատ օքսիդանտ, ավելի մեծ սպառում կամ ավելի մեծ վնասում։

Կարևորն այս տողերի ընդհանուր օրինաչափությունն է։ Պերօքսիդի արտադրությունն ու կենսաբանական պաշտպանությունը առանձին առանցքներ են։ Նույն միջամտությունը կարող է միաժամանակ անբարենպաստ գնահատվել առաջինով և դրական՝ երկրորդով։

Ինչու է նույն դոզան տարբեր պատասխաններ տալիս

Կոնցենտրացիան սահմանում է փոխանցման կարողությունը, ոչ թե վերջնական արդյունքը։ Ուղեղի ամբողջական միտոքոնդրիումների ուսումնասիրությունում ուղեղի միտոքոնդրիումներից պերօքսիդի արտազատումը հայտնաբերելիորեն աճել է 50 nM-ից սկսած, մինչդեռ մթության մեջ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի ակնհայտ վնասման համար անհրաժեշտ է եղել 100 uM։ Առաջին ազդանշանի և գենոտոքսիկության միջև սա մոտավորապես երկու հազար անգամ տարբերություն է, բայց անվտանգության սահման չէ։ Վերջնակետերը, կոմպարտմենտները և ազդեցության տևողությունները տարբեր են, ուստի թվերը նշում են տարբեր երևույթներ, այլ ոչ թե մեկ կորի կետեր։ Դոզա–արձագանք քննարկումը ցածր մակարդակի ազդանշանի և բարձր մակարդակի վնասման միջև այսպիսի տարբերությունը դիտարկում է հորմեզիսի ավելի լայն համատեքստում։

Սուբստրատն է որոշում, թե որտեղից են մուտք գործում էլեկտրոնները։ NADH-ի հետ կապված էներգետիկ սուբստրատները ներկանյութին տրամադրում են առատ վերականգնող համարժեքներ՝ ինչպես օգտակար շրջանցող ուղու, այնպես էլ թթվածնի հետ անարդյունավետ ռեակցիայի համար։ Հաճախ մեջբերվող ամփոփումը, թե սուկցինատը ներկանյութը դարձնում է հակաօքսիդանտ, իսկ գլուտամատը՝ պրոօքսիդանտ, տվյալներից չափազանց հեռուն գնացող եզրակացություն է։ Սրտի ուսումնասիրությունում պերօքսիդը չափելու սուկցինատային պայմանը նաև ռոտենոն էր պարունակում և կիրառվել էր այլ հյուսվածքի ու դոզայի դեպքում, քան ուղեղի ուսումնասիրությունը, որը հայտնաբերել էր պերօքսիդի ավելացում բոլոր սուբստրատների և շնչառական վիճակների դեպքում։

Լույսը փոխում է մեխանիզմը, ոչ միայն ազդեցության մեծությունը։ Այս տվյալների շարքում ամենահստակ հակադրությունն այն է, որ մթության մեջ 20 uM-ը միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի հատվածների վրա հայտնաբերելի ազդեցություն չի ունեցել, իսկ կարմիր լույսի տակ 20 uM-ը վնասել է դրանք բոլորը։ Լուսավորված փորձը մթության մեջ անցկացվածի հետ համեմատողը համեմատում է լուսաքիմիան օքսիդավերականգնման ցիկլի հետ։

Մետաղները փոխակերպում են օքսիդանտը։ Առանց մետաղների ներկանյութի մթության ցիկլն առաջացնում է պերօքսիդ՝ դիֆուզվող մոլեկուլ, որը բջիջներն օգտագործում են նաև որպես ազդանշան։ Հասանելի պղնձի կամ երկաթի առկայության դեպքում NADH-ով վերականգնված ներկանյութն ապահովում է մետաղի վերականգնումը, իսկ վերականգնված մետաղը ԴՆԹ-ի կողքին պերօքսիդը փոխակերպում է հիդրօքսիլային տիպի կամ պղնձի պերօքսիդային մասնիկների։ Այդ կերպ NADH-ով և մետաղի իոններով՝ առանց բջիջների կատարված աշխատանքում նույն սկզբնական ներկանյութից առաջացել են ԴՆԹ-ի թե՛ հաճախակի վնասվող հատվածներին ուղղված ընտրողական, թե՛ լայնածավալ վնասումներ։ Այս ճյուղի կարևորությունը որոշում է տվյալ կոմպարտմենտում մետաղների կարգավորումը, ոչ թե միայն ներկանյութը։

Էներգետիկ ապահովվածությունն է որոշում՝ արդյոք բջիջը կարող է վճարել այդ գինը։ 2-ից 20 uM ներկանյութի ազդեցությանը ենթարկված էնդոթելային բջիջներում գլյուկոզայի հեռացումը բացահայտել է օքսիդանտային ծախսը, իսկ գլյուկոզայի մատակարարումը վերացրել է այն, թեև գլյուկոզան նաև արագացրել է ներկանյութի վերականգնումը։ Ապահովված պաշտպանությամբ ավելի արագ ցիկլն ավելի շահեկան է, քան սպառված պաշտպանությամբ դանդաղ ցիկլը։ Օքսիդանտների վերաբերյալ ցանկացած պնդում, որը չի նշում գլյուկոզայի կամ NADPH-ի վիճակը, համարեք թերի։

Հյուսվածքն է որոշում առկա կենսաբանական սարքակազմը։ Էնդոթելային բջիջները գլյուկոզայի նյութափոխանակությամբ վերագեներացնում են NADPH-ը և ունեն ցիտոզոլային հակաօքսիդանտների պաշարներ։ Մեկուսացված միտոքոնդրիումներն այդ ամենը չունեն։ Մաքրված ԴՆԹ-ն նույնիսկ վերականգնման համակարգ չունի։ Մի պատրաստուկում ստացված արդյունքը քիչ բան է կանխատեսում մյուսների մասին, ուստի հյուսվածքներին բնորոշ արձագանքների վերաբերյալ նախատեսվող հոդվածում այս համակարգերը պետք է դիտարկվեն առանձին։

Ուղղակի չափումը հետագա պաշտպանական արձագանքը չէ

Շատ տեքստերում միավորվում են երկու մակարդակներ, որոնք փորձերում տարանջատվում են։ Մեկ մակարդակում հարցն այն է, թե որքան օքսիդանտ է առաջացել։ Մյուսում՝ թե ինչպես է բջիջն արձագանքել։

Amplex-ի տիպի պերօքսիդային չափումները ամենամոտն են առաջին մակարդակին, և նույնիսկ դրանք ցույց են տալիս զուտ հոսքը՝ արտադրությունը հանած քայքայումն ու դուրսբերումը։ Ուղեղի միտոքոնդրիումների ուսումնասիրությունը հայտնաբերել է փոփոխություն երկու կողմում էլ․ ավելի շատ պերօքսիդ է առաջացել, և ավելի դանդաղ է հեռացվել միանգամից ավելացված պերօքսիդի չափաբաժինը։ Ավելի ուշ փուլերում են գլուտաթիոնի օքսիդացումը, ասկորբատի սպառումը, օքսիդացված գուանինը և ԴՆԹ-ի՝ պոլիմերազը արգելափակող վնասումները։ Յուրաքանչյուր քայլ օքսիդանտի և չափվող ցուցանիշի միջև ավելացնում է կենսաբանական գործընթացներ։

Nrf2-ով պայմանավորված հակաօքսիդանտային ֆերմենտներն ու միտոքոնդրիալ կենսագոյացումը պատկանում են երկրորդ մակարդակին։ Դրանք հարմարվողական ծրագրեր են, որոնք կարող է գործարկել պերօքսիդի թույլ իմպուլսը։ Ուղեղի միտոքոնդրիումների պաշտպանության ուսումնասիրության հեղինակները առաջարկում են հենց այդպիսի թույլ սթրեսային գործարկիչ՝ միաժամանակ նշելով, որ Nrf2-ի միջոցով պատճառահետևանքային շղթան հիմնված է նախորդ աշխատանքների, ոչ թե իրենց լիարժեք ապացուցման վրա։ Նոր սպիտակուցների միջոցով ժամեր անց ձևավորվող պաշտպանությունը չի նշանակում, որ սկզբնական քիմիական գործընթացը հակաօքսիդանտային էր։ Դա նշանակում է, որ փոքր պրոօքսիդանտային իրադարձությունը ապահովել է ավելի մեծ պաշտպանություն։ Նման պնդումները գնահատելու սկզբունքները, ներառյալ չափման մեթոդների սահմանափակումներն ու պատրաստուկների տարբերությունները, ներկայացված են մեթիլենային կապույտի հետազոտությունները կարդալու ուղեցույցում։

Ինչու են չափման մեթոդները հակասական արդյունքներ տալիս

Դիհիդրոֆլուորեսցեինի նման ընդհանուր զոնդը ցույց է տալիս զոնդի ընդհանուր օքսիդացումը, ոչ թե պերօքսիդի կոնցենտրացիան։ Այն կախված է պերօքսիդազային և հեմային քիմիայից և կարող է չհայտնաբերել պերօքսիդի աճը, որն արձանագրում է տրամաչափված Amplex մեթոդը։ Ուղեղի միտոքոնդրիումների ուսումնասիրությունում պերօքսիդի քանակը կտրուկ աճել է՝ առանց համապատասխան սուպերօքսիդային ազդանշանի։ Սա զգուշացում է՝ չմեջբերել որևէ հակաօքսիդանտային պնդում, որը հիմնված է միայն մեկ ներկանյութային չափման վրա։ Օպտիկական համընկնումը վերահսկիչ փորձով ստուգելու հիմնավոր հարց է, քանի որ ներկանյութը կլանում է տեսանելի լույսը տարածված գրգռման և ճառագայթման տիրույթների մոտ։ Սակայն մանրակրկիտ ուսումնասիրությունում տրամաչափումը կատարվել է պերօքսիդի հայտնի քանակների նկատմամբ, գրգռող լույսի ազդեցությունը նվազեցվել է՝ ազդանշանի փոքր փոփոխությամբ, և առանձին էլեկտրոդով հաստատվել է պերօքսիդի ավելի դանդաղ հեռացումը։ Միջամտող ազդեցությունը պետք է ստուգել վերահսկիչ փորձով, ոչ թե օգտագործել որպես արդյունքն ինքնաբերաբար մերժելու հիմք։

Կալցիումի արդյունքը ցույց է տալիս ճշգրտության նույն անհրաժեշտությունը։ Սրտի ուսումնասիրությունում ներկանյութի կարճատև ազդեցությունը չի փոխել կալցիումի ընդհանուր բեռնվածությունը մինչև թափանցելիության անցումը, սակայն բարելավել է կալցիումի կլանման արագությունը ուղեղի արգելափակված միտոքոնդրիումներում՝ դիաբետի վրա կենտրոնացած սրտի միտոքոնդրիումների ուսումնասիրությունում։ Տարբեր վերջնակետեր, տարբեր համակարգեր, ոչ մի հակասություն։

Ստուգացանկ՝ եզրակացությանը վստահելուց առաջ

Հակաօքսիդանտային կամ պրոօքսիդանտային յուրաքանչյուր եզրակացություն դիտարկեք որպես տվյալ համակարգի մասին հաղորդում և տվեք հինգ հարց։ Ի՞նչ կոնցենտրացիայով և ո՞ր կոմպարտմենտում։ Էլեկտրոնների ո՞ր դոնորով և ո՞ր մրցակցող ընդունողով։ Լույսի տա՞կ, թե՞ մթության մեջ, և ի՞նչ ալիքի երկարությամբ ու դոզայով։ Ի՞նչ հասանելի մետաղներով և էներգետիկ սուբստրատների ու հակաօքսիդանտների ի՞նչ ապահովված պաշարներով։ Եվ ո՞ր չափման մեթոդով՝ չափելով օքսիդանտի հոսքը, վնասումը, թե հարմարվողական արձագանքը։ Փոխեք թեկուզ մեկ պատասխան, և նույն մոլեկուլը կարող է մատրիցում պաշտպանականից անցնել վնասող ազդեցության՝ առանց որևէ պարադոքսի։