Մեթիլենային կապույտը և ֆերոպտոզը․ երկաթ, լիպիդների պերօքսիդացում և բջջային մահ

Ֆերոպտոզը թաղանթի վնասման հետևանքով առաջացող բջջային մահ է։ Թաղանթների բազմաչհագեցած ճարպերը շղթայական ռեակցիայով օքսիդանում են, թաղանթը կորցնում է իր ամբողջականությունը, և բջիջը մահանում է։ Այս քիմիական գործընթացի համար երկաթ է անհրաժեշտ։ Այդ նախադասությունն ամփոփում է ամբողջ հասկացությունը, իսկ այս հոդվածում ամեն ինչ դրա առանձին մասի ստուգումն է։

Այստեղ հարցն ավելի նեղ է․ բջջային փորձերում մեթիլենային կապույտն ինչպե՞ս է ազդում այդ շղթայի վրա, և ի՞նչ է իրականում ցույց տալիս ստացված արդյունքը։ Կարճ պատասխանն այն է, որ երկու լաբորատոր հետազոտություններում նանոմոլային կոնցենտրացիաներով մեթիլենային կապույտը նվազեցրել է միտոքոնդրիալ լիպիդների պերօքսիդացումը և պահպանել բջիջների կենսունակությունն այնպիսի հարուցիչների ազդեցությունից հետո, որոնք այլապես ֆերոպտոզ են առաջացնում։ Ավելի մանրամասն պատասխանն ավելի կարևոր է, քանի որ շղթայի յուրաքանչյուր օղակ ստուգվել է տարբեր միջամտությամբ, և յուրաքանչյուր միջամտություն ունի իր սահմանափակումները։

Ֆերոպտոզը՝ մեկ պարբերությամբ

Բազմաչհագեցած ճարպաթթվային պոչ ունեցող թաղանթային ֆոսֆոլիպիդն ունի խոցելի տեղ՝ ջրածնի ատոմներ, որոնք հեշտ է պոկել։ Երբ ռադիկալը պոկում է դրանցից մեկը, թթվածինը միանում է լիպիդին, առաջանում է լիպիդային պերօքսիլ ռադիկալ, և այդ ռադիկալը ջրածին է պոկում հաջորդ լիպիդից։ Ռեակցիան տարածվում է թաղանթի երկայնքով, եթե ինչ-որ բան այն չի կանգնեցնում։

Գլխավոր արգելակող գործոնը GPX4 կոչվող ֆերմենտն է, որը գլուտաթիոնի միջոցով լիպիդային պերօքսիդները վերականգնում է՝ դարձնելով անվնաս լիպիդային սպիրտներ։ Լաբորատոր հարուցիչները հարվածում են այս պաշտպանությանը հստակ որոշված կետերում։ Էրաստինն արգելափակում է ցիստինի ներմուծումը xc-minus համակարգով՝ բջիջը զրկելով գլուտաթիոնի սինթեզի համար անհրաժեշտ ցիստեինից։ Բութիոնին սուլֆօքսիմինն ուղղակիորեն արգելափակում է գլուտաթիոնի սինթեզը։ RSL3-ն արգելակում է հենց GPX4-ը։ Բոլոր երեքի դեպքում պերօքսիդները մնում են չվերացված, բայց դա տեղի է ունենում տարբեր փուլերում, ուստի մեկ հարուցիչով ստացված արդյունքն ինքնաբերաբար չի տարածվում մյուսների վրա։

Ֆերոպտոզն ապոպտոզից տարբերվում է այն բնորոշող հատկություններով։ Չկա կասպազների կասկադ, և չեն առաջանում ապոպտոտիկ մարմնիկներ։ Երկաթի խելատորները, օրինակ՝ դեֆերօքսամինը, և ռադիկալները որսացող նյութերը, օրինակ՝ ֆերոստատին-1-ը, ճնշում են այն․ սա այն գործնական ստուգումն է, որով հետազոտողները մահը բնորոշում են որպես ֆերոպտոտիկ, այլ ոչ թե պարզապես նեկրոտիկ։ Կարգավորվող բջջային մահվան ուղիների ավելի լայն պատկերը թույլ է տալիս այս տարբերությունը դիտարկել ընդհանուր համատեքստում, իսկ բջիջներում լաբիլ երկաթի կարգավորումը բացատրում է, թե ինչու է խելատավորումն այդքան վճռորոշ ստուգիչ միջամտություն։

Որտեղ են ներգրավվում միտոքոնդրիումները, և ինչու էր դա վիճարկվում

Վաղ աշխատանքներում հաղորդվել էր, որ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ չունեցող բջիջները նույնպես ենթարկվում են ֆերոպտոզի, ինչը հուշում էր, որ միտոքոնդրիումները պարտադիր չեն։ Ավելի ուշ աշխատանքները ցույց տվեցին, որ միտոքոնդրիումների քանակի նվազեցումը կամ շնչառության արգելափակումը կարող են ճնշել ցիստեինի պակասից առաջացող ֆերոպտոզը, բայց ոչ GPX4-ի ուղղակի արգելակումից առաջացողը։ Երկու արդյունքներն էլ կարող են ճիշտ լինել, եթե միտոքոնդրիումների մասնակցությունը կախված է հարուցիչից, բջջի տեսակից և այն բանից, թե որտեղ է տեղի ունենում վճռորոշ պերօքսիդացումը։

Այս հոդվածի հիմքում ընկած հետազոտությունը վիճելի հարցն ուսումնասիրել է բջջային որոշակի բաժանմունքի համար նախատեսված զոնդով։ MitoCLox-ը լիպիդների պերօքսիդացման ցուցիչի՝ միտոքոնդրիումներին թիրախավորված տարբերակ է․ դրա ֆլուորեսցենցիան փոխվում է, երբ այն միտոքոնդրիումների ներսում հանդիպում է լիպիդային պերօքսիլ ռադիկալների։ Էրաստինով մշակված ֆիբրոբլաստներում միտոքոնդրիալ զոնդի օքսիդացումը հայտնվել է դեռ կենդանի բջիջներում՝ մահից առաջ, և բջջային պոպուլյացիայում անհամասեռ է եղել։ Այդ ժամանակային հաջորդականությունը կարևոր է։ Մահվանը նախորդող պերօքսիդացումը կարող է պատճառ լինել։ Միայն մահացած բջիջներում չափված պերօքսիդացումը քայքայման մնացորդ է։ Լիպիդների պերօքսիդացման փորձերի և յուրաքանչյուր զոնդի հաղորդած տվյալների ուղեկցող ուղեցույցը բացատրում է, թե ինչու է զոնդի տեղակայումը որոշում ազդանշանի նշանակությունը։

Նույն օրինաչափությունը հայտնվել է երկրորդ մոդելում։ Լեբերի ժառանգական օպտիկական նյարդաբանությամբ հիվանդից ստացված ֆիբրոբլաստները, որոնք ունեն I համալիրի մուտացիա և ավելի բարձր սկզբնական օքսիդատիվ սթրես, գլուտաթիոնի սպառման դեպքում մահացել են ֆերոպտոզով, մինչդեռ հսկիչ ֆիբրոբլաստները դիմակայել են։ Միտոքոնդրիալ զոնդի օքսիդացումը կրկին տեղի է ունեցել առաջինը։ Մանրամասները ներկայացված են ֆիբրոբլաստներում ֆերոպտոզի ժամանակ միտոքոնդրիալ լիպիդների պերօքսիդացման հետազոտությունում։

Ինչ փոխեց մեթիլենային կապույտն այս փորձերում

Մեթիլենային կապույտը օքսիդավերականգնման կրիչ է։ Դրա օքսիդացած ձևն ընդունում է էլեկտրոններ I համալիրում NADH-ի հետ կապված քիմիական գործընթացներից, իսկ վերականգնված ձևը դրանք փոխանցում է ցիտոքրոմ c-ին, որն էլ սնուցում է IV համալիրը։ Այսպիսով մասնակիորեն շրջանցվում է շղթայի այն հատվածը, որտեղ էլեկտրոնները սովորաբար արտահոսում են դեպի թթվածին՝ առաջացնելով սուպերօքսիդ։ Էլեկտրոնների փոխանցման ամբողջական պատկերը հասկանալ ցանկացող ընթերցողները կարող են սկսել միտոքոնդրիումներում մեթիլենային կապույտի միջոցով էլեկտրոնների տեղափոխման նկարագրությունից։

Էրաստինով մշակված թոքային ֆիբրոբլաստներում 250 նանոմոլային կոնցենտրացիայով մեթիլենային կապույտը բջիջների գոյատևման փորձի տվյալներով պահպանել է կենսունակությունը՝ միտոքոնդրիումներին թիրախավորված SkQ1 և MitoTEMPO հակաօքսիդանտների նման։ Հսկիչ միջամտությունները սահմանում են եզրակացության շրջանակը։ Ֆերոստատին-1-ը, ալֆա-տոկոֆերոլը և դեֆերօքսամինը նույնպես պաշտպանել են բջիջները, ինչը հաստատում է, որ մահը ֆերոպտոտիկ էր։ Հակաօքսիդանտային խումբ չունեցող SkQ1-ի անալոգը չի պաշտպանել, ինչը վկայում է օքսիդավերականգնման քիմիայի, այլ ոչ թե ոչ սպեցիֆիկ կուտակման դերի մասին։ SkQ1-ի՝ մոտավորապես 200 նանոմոլայինից բարձր կոնցենտրացիաներում պաշտպանությունը թուլացել է, ինչը համահունչ է ավելի մեծ քանակներով քինոնային հակաօքսիդանտների հայտնի պրոօքսիդանտային վարքին։ Մեթիլենային կապույտն ունի կոնցենտրացիայից կախված նույն երկակի վարքը․ այս բջջային կուլտուրաներում ցածր նանոմոլային մակարդակներում այն պաշտպանիչ է, իսկ ավելի բարձր կոնցենտրացիաներում կամ ուժեղ լուսավորման դեպքում կարող է օքսիդավերականգնման ցիկլերի միջոցով ջրածնի պերօքսիդ առաջացնել։ Կոնցենտրացիայի այսպիսի համատեքստը քննարկվում է միտոքոնդրիումներում թթվածնի ռեակտիվ ձևերի մասին հոդվածում։

Այնուհետև մեկուսացված միտոքոնդրիումներով փորձերն առանձնացրել են ROS-ի աղբյուրները։ Երկվալենտ երկաթի առկայությամբ I համալիրը սնուցող սուբստրատները՝ ռոտենոնի հետ միասին, խթանել են զոնդի օքսիդացումը։ Ռոտենոնն արգելափակում է փոխանցումը ֆլավինային տեղամասից հետո, ուստի նախորդող կրիչները մնում են վերականգնված, և մատրիքսի կողմում գտնվող ֆլավինից էլեկտրոններն արտահոսում են դեպի թթվածին։ III համալիրը սնուցող սուբստրատները՝ անտիմիցին A-ի հետ միասին, առաջացրել են առատ ջրածնի պերօքսիդ, բայց չեն խթանել լիպիդների պերօքսիդացումը։ ROS-ի նույն ընդհանուր ազդանշանը, տարբեր տեղակայում, տարբեր արդյունք։ SkQ1-ը և մեթիլենային կապույտը երկուսն էլ ճնշել են I համալիրով պայմանավորված պերօքսիդացումը՝ առանց ճնշելու բուն ջրածնի պերօքսիդի արտադրությունը։ Սա նրանց ազդեցությունը տեղադրում է ROS-ի առաջացումից հետո՝ լիպիդների պերօքսիդացման փուլում։

Երկաթով գերբեռնվածության ուղղությունը և լիպոֆուսցինի հուշումը

Երկրորդ հետազոտությունը հարցին մոտեցել է երկաթի կողմից։ Երկաթի(III) ամոնիումի ցիտրատի սուբմիլիմոլային կոնցենտրացիաների ազդեցությանը ենթարկված H9c2 կարդիոմիոցիտներում առաջացել են միտոքոնդրիալ ROS, միտոքոնդրիալ լիպիդների պերօքսիդացում, ապա՝ ֆերոպտոզ, որին հաջորդել է լիպոֆուսցինանման գունանյութի կուտակում՝ 24 ժամվա ընթացքում։ Լիպոֆուսցինը օքսիդացած լիպիդների և սպիտակուցների ինքնաֆլուորեսցենտ, երկաթ պարունակող մնացորդն է, որը կուտակվում է տարիքի հետ։ Այստեղ դրա արագ առաջացումը երկաթով պայմանավորված սուր պերօքսիդացումը կապում է ծերացման դասական ցուցիչի հետ։ Նանոմոլային մեթիլենային կապույտը և SkQ1-ը յուրաքանչյուրը կանխել են պերօքսիդացումը, մահը և գունանյութի կուտակումը։ Մեկուսացված սրտային միտոքոնդրիումները հաստատել են օրինաչափությունը․ ռոտենոնը՝ երկվալենտ երկաթի հետ միասին, խթանել է պերօքսիդացումը և գունանյութին բնորոշ ազդանշանը, իսկ երկու նյութերն էլ արգելափակել են դրանք։ Ամբողջ հաջորդականությունը ներկայացված է H9c2 կարդիոմիոցիտներում երկաթով գերբեռնվածության հետազոտությունում։ Գունանյութին վերաբերող կողմը քննարկվում է լիպոֆուսցինի և բջջային ծերացման ցուցիչների մասին հոդվածում։

Ինչ չեն ցույց տալիս բջիջների գոյատևման փորձերը

Կենսունակության գնահատման այնպիսի մեթոդը, ինչպիսին է CellTiterBlue-ը, ցույց է տալիս, թե փորձանոթում քանի բջիջ է մնում նյութափոխանակային առումով ակտիվ՝ հարուցիչի և հնարավոր պաշտպանիչ նյութի ազդեցությունից հետո։ Սա որոշակի համակարգում մեխանիզմի ստուգում է։ Այն բուժման արդյունք չէ։ Այս փորձերից ոչ մեկում նյութը չի տրվել հիվանդի, չի չափվել հիվանդության ելքային ցուցանիշ և չի սահմանվել օրգանիզմում թերապևտիկ միջակայք։

Չորս սահմանափակում արժանի են հստակ նշման։ Նախ՝ բջիջների տեսակների շրջանակը նեղ է․ տրանսֆորմացված թոքային ֆիբրոբլաստներ, մաշկի առաջնային ֆիբրոբլաստներ՝ ներառյալ միտոքոնդրիալ հիվանդություն ունեցող մեկ բջջային գիծ, և առնետի կարդիոմիոցիտների գիծ, ինչպես նաև առնետի սրտից մեկուսացված միտոքոնդրիումներ։ Զգայունությունը տարբեր է եղել ըստ գծի, իսկ LHON գիծն ի սկզբանե ընտրվել է որպես անսովոր խոցելի մոդել։ Երկրորդ՝ հարուցիչները լաբորատոր ծայրահեղություններ են․ փոխադրման կամ սինթեզի լիակատար արգելափակում և երկաթի այնպիսի բեռներ, որոնց ոչ մի հյուսվածք սուր պայմաններում չի ենթարկվի։ Երրորդ՝ կոնցենտրացիան պարզապես բազմապատկելով հնարավոր չէ այն վերածել դեղաչափի։ Կուլտուրայի միջավայրում նանոմոլային կոնցենտրացիան մարդու համար դեղաչափ չէ։ Փորձանոթից մարդուն անցնելու ճանապարհին առկա են մեթիլենային կապույտի բաշխումը, արյան ու հյուսվածքների մեջ դրա վերականգնումն անգույն ձևի, լույսի ազդեցությունը և թաղանթային պոտենցիալը։ Չորրորդ՝ զոնդերը տեղեկություն են տալիս իրենց տեղակայման բաժանմունքի մասին։ MitoCLox-ի օքսիդացումը ցույց է տալիս, որ առաջացել են միտոքոնդրիալ լիպիդային ռադիկալներ․ այն չի ցույց տալիս, թե պլազմային թաղանթի պատռվածքը՝ հավանական վերջնական իրադարձությունը, ուղղակիորեն է կանխվել, թե խուսափվել է դրանից ավելի վաղ փուլում։

Ուստի հիմնավորված եզրակացությունն այսպիսին է․ այս մոդելներում I համալիրից ծագող ROS-ը՝ երկաթի հետ միասին, խթանում է միտոքոնդրիալ լիպիդների պերօքսիդացումը, որը նախորդում է ֆերոպտոզին, իսկ ցածր կոնցենտրացիաներով մեթիլենային կապույտն ընդհատում է այդ հատվածը։ Այդ հատվածից դուրս ցանկացած եզրակացության համար անհրաժեշտ են այլ փորձեր՝ նախ կենդանիների, ապա մարդկանց մասնակցությամբ։