Մեթիլեն կապույտի այլընտրանքները մանրադիտման համար․ ընտրեք ըստ առաջադրանքի

Պարզ բակտերիալ քսուկի դեպքում բյուրեղային մանուշակագույնը կարող է փոխարինել մեթիլեն կապույտին, երբ նպատակը բջջի ձևը տեսնելն է։ Կենդանի բջիջների դեպքում ավելի հարմար այլընտրանք կարող է լինել փուլային հակադրությամբ դիտումը՝ ընդհանրապես առանց ներկման։ Ընտրությունը կախված է այն դիտարկումից, որը պետք է կատարեք։

Ենթադրենք՝ երկու մարդ ուսումնասիրում են նույն բակտերիալ կուլտուրան։ Մեկը ցանկանում է տարբերակել ձողաձև բջիջները կլոր բջիջներից։ Մյուսը ցանկանում է պարզել՝ արդյոք մշակումը ոչնչացրել է բակտերիաները։ Ներկանյութը, որը առաջինին հստակ պատկեր է տալիս, երկրորդին կարող է չտալ օգտագործելի պատասխան։

Փոխարինիչ ընտրելուց առաջ լրացրեք այս նախադասությունը․ «Ես պետք է դիտարկեմ ___՝ ___-ում, և բջիջները պետք է / պարտադիր չէ, որ կենդանի մնան»։ Այդ նախադասությունը սահմանում է այն խնդիրը, որը պետք է կատարի ներկանյութը։

Սկսեք նմուշից և հարցից

Նախ որոշեք՝ արդյոք բջիջները պետք է կենդանի մնան, ապա հստակեցրեք այն հատկանիշը, որը պետք է դիտարկեք․

• Բջիջները պետք է կենդանի մնան․ շարժումը կամ ձևը դիտարկելու համար դիտարկեք առանց ներկման փուլային հակադրությունը կամ DIC-ը, կորիզային DNA-ի համար՝ Hoechst 33342-ը ֆլուորեսցենտային մանրադիտմամբ, իսկ թաղանթի ամբողջականության համար ընտրեք վավերացված անալիզ, օրինակ՝ SYTO 9-ը propidium iodide-ի հետ։
• Բջիջները պարտադիր չէ, որ կենդանի մնան․ բակտերիալ մորֆոլոգիայի համար դիտարկեք բյուրեղային մանուշակագույնով պարզ ներկումը կամ նիգրոզինով բացասական ներկումը, Գրամի ռեակցիայի համար օգտագործեք Գրամի ներկման ամբողջական մեթոդը, իսկ ֆիքսված բջիջներում կորիզային DNA-ի համար՝ DAPI ֆլուորեսցենցիան։

Այս աղյուսակով համեմատեք յուրաքանչյուր ճյուղի սահմանափակումները։ Սրանք մեթոդի ընտրության տարբերակներ են, ոչ թե գործող արձանագրության ներսում մի շիշը մյուսով փոխարինելու հրահանգներ։

Պարզ քսուկի դեպքում մեթոդը փոխարինեք զգուշորեն

Բյուրեղային մանուշակագույնը գործնական թեկնածու է, երբ խնդիրը բակտերիալ մորֆոլոգիան մեկ գույնով դիտելն է։ FDA-ի Bacteriological Analytical Manual-ը ներկայացնում է պարզ ներկման համար հարմար բյուրեղային մանուշակագույնի երկու կազմ։ Օգտագործեք փաստաթղթավորված կազմ և դրա պատրաստման մեթոդը․ միայն ներկանյութի անվանումը չի սահմանում աշխատանքային ռեագենտը։

Բյուրեղային մանուշակագույնը կիրառվում է նաև Գրամի ներկման ժամանակ, բայց դա չի նշանակում, որ բյուրեղային մանուշակագույնով պարզ ներկումը Գրամի ներկում է։ ASM-ի Գրամի ներկման արձանագրությունում տարբերակիչ արդյունքը կախված է բյուրեղային մանուշակագույնի, յոդի, գունազրկման և հականերկման հաջորդական ազդեցությունից։ Այդ քայլերից որևէ մեկը բաց թողնելը փոխում է այն, ինչ կարելի է հաստատել պատկերով։ Այդ տարբերակման համար տես պարզ ներկումը՝ համեմատած Գրամի ներկման հետ։

Նիգրոզինը ուրվագծերը տեսանելի դարձնելու այլ եղանակ է առաջարկում․ այն մգացնում է ֆոնը, մինչդեռ բակտերիալ բջիջները համեմատաբար բաց են մնում։ Merck-ի նիգրոզինի հրահանգներում կա կարևոր մանրամասն, որը փոխարինիչների ընդհանուր ցանկում կարող է բաց թողնվել։ Նշված աշխատանքային կազմը պարունակում է ֆորմալդեհիդ։ Հետևաբար միայն «բացասական ներկում» արտահայտությունից չի կարելի եզրակացնել, որ մեթոդը համատեղելի է կենդանի բջիջների հետ, նույնիսկ եթե բջիջներն իրենք չներկված են երևում։ Ստուգեք ամբողջ կազմը և նմուշի պատրաստման եղանակը։

Կենդանի նմուշների դեպքում դիտարկեք օպտիկան փոխելու տարբերակը

Եթե ցանկանում եք հետևել բջիջների շարժմանը կամ բաժանմանը, մեկ այլ ներկանյութ ավելացնելը կարող է բարդացնել դիտարկումը։ Ինչպես Nikon-ը բացատրում է թափանցիկ նմուշների հակադրության ուղեցույցում, փուլային հակադրությունը և դիֆերենցիալ ինտերֆերենցիոն հակադրությունը՝ DIC-ը, նմուշները տեսանելի են դարձնում դրանց օպտիկական հատկությունների տարբերությունների միջոցով։ Դրանք կարող են ցույց տալ կենդանի, չներկված բջիջները, եթե մանրադիտակն ունի անհրաժեշտ բաղադրիչները։

Այս ընտրությունը պահպանում է պատրաստուկը չներկված վիճակում, սակայն փոխում է հասանելի տեղեկատվությունը։ Կարելի է հետևել սահմանագծին կամ շարժմանը՝ առանց իմանալու, թե որ մոլեկուլն է առաջացրել հակադրությունը։ Եթե հարցը մոլեկուլային տեղայնացումն է, փոխարենը ընտրեք համապատասխան պիտակավորման մեթոդ։

Կորիզային DNA-ի համար Invitrogen-ի DAPI և Hoechst ներկանյութերի համեմատությունը տարբերակում է DAPI-ի տարածված կիրառումը ֆիքսված բջիջների հետ և բջիջների թաղանթով ավելի հեշտ անցնող Hoechst 33342-ը, որը նախընտրելի է կենդանի բջիջների պիտակավորման համար։ Երկուսն էլ պահանջում են ֆլուորեսցենտային սարքավորում։ Դրանցից ոչ մեկը գունավոր brightfield ներկանյութի ուղղակի փոխարինիչ չէ։

Ներկանյութի ազդեցությունն ու լուսավորությունը դիտարկեք որպես փորձարարական պայմաններ։ Եթե չափում եք բջիջների վարքը, համեմատեք ներկված և չներկված պատրաստուկները։

Կարմիր բջիջը ինքնաբերաբար մահացած բջիջ չէ

SYTO 9-ը և propidium iodide-ը հաճախ համակցվում են բակտերիալ թաղանթի ամբողջականությունը գնահատելու համար։ BacLight-ի ձեռնարկը ամբողջական թաղանթները կապում է կանաչ ներկման, իսկ վնասված թաղանթները՝ կարմիր ներկման հետ։ Այդ մեկնաբանությունը պետք է վավերացվի տվյալ նմուշի համար։

Rosenberg-ի և գործընկերների 2019 թվականի հետազոտությունը ցույց է տալիս խնդիրը։ Ֆոսֆատային բուֆերային աղային լուծույթում ապակու վրա աճեցված 24-hour E. coli կենսաթաղանթներում բջիջների մոտ 96%-ը տեղում դիտարկելիս propidium-iodide-positive էր երևում։ Սակայն հեղինակները գնահատել են, որ հավաքումից հետո 82%-ը մշակելի էր։ Կոնֆոկալ պատկերներում կարմիր ներկված նյութի տակ երևում էին կանաչ ներքին հատվածներով բջիջներ, ինչը մոլորեցնող ազդանշանի մեջ մատնանշում էր արտաբջջային նուկլեինաթթուների դերը։

Այդ տոկոսները նկարագրում են հետազոտության պատրաստուկների վրա կատարված տարբեր չափումներ և համընդհանուր ուղղման գործակից չեն։ Գործնական հետևությունն այն է, որ պետք է ստուգել, թե ինչն է առաջացրել ազդանշանը։ Կենսաթաղանթում նուկլեինաթթուների ներկանյութը կարող է հայտնաբերել նյութ ինչպես բջիջներից դուրս, այնպես էլ վնասված բջիջների ներսում։ Կենսունակության վերաբերյալ եզրակացության համար հետազոտողները խորհուրդ են տալիս լրացուցիչ չափումներ, օրինակ՝ կուլտիվացում կամ մետաբոլիկ ակտիվության գնահատում՝ միաժամանակ ընդունելով, որ յուրաքանչյուր մեթոդ սահմանափակումներ ունի։

Ստուգեք, թե այլընտրանքն իրականում ինչ է պարունակում

Այլընտրանքային ներկման մեթոդը կարող է դեռևս պարունակել մեթիլեն կապույտ։ Giemsa-ն օրինակ է․ Merck-ը իր արտադրանքը նկարագրում է որպես azure-eosin-methylene-blue լուծույթ, որը նախատեսված է, ի թիվս այլ կիրառությունների, արյան և ոսկրածուծի քսուկների համար։ Այն կարող է լինել այլ մեթոդ՝ այլ նմուշի համար, բայց չի բավարարում մեթիլեն կապույտը բացառելու պահանջին։

Եթե որևէ միացություն բացառելը փորձի մաս է, պատկերները համեմատելուց առաջ ստուգեք ռեագենտի ինքնությունն ու կազմը։ Methyl blue-ի, methylene blue-ի և նման անվանումներով ներկանյութերի ուղեցույցը բացատրում է անվանումների տարբերությունները։

Փոխարինումը ստուգեք նախքան արդյունքն օգտագործելը

Նոր մեթոդի դեպքում կատարեք փոքր համեմատություն՝ օգտագործելով ներկայացուցչական նմուշներ և համապատասխան վերահսկիչ։ Հնարավորության դեպքում մանրադիտակի կարգավորումները պահեք համադրելի։ Գրանցեք ռեագենտի կազմը, նմուշի պատրաստումը, ազդեցության պայմանները և պատկերման պայմանները, որպեսզի ավելի լավ երևացող պատկերը հնարավոր լինի ուսումնասիրել, այլ ոչ թե պարզապես նախընտրել։

Հաջողությունը գնահատեք սկզբնական հարցի համեմատ։ Մորֆոլոգիայի համար գնահատեք՝ արդյոք բջիջների սահմաններն ու դասավորությունը շարունակում են հստակ մեկնաբանելի լինել։ Կորիզային պիտակավորման համար գնահատեք ազդանշանի տեղադրությունն ու ֆոնը։ Կենսունակության համար պահանջեք ապացույցներ, որոնք չեն սահմանափակվում գրավիչ գունային տարանջատմամբ։ Մեթիլեն կապույտով ներկման և լաբորատոր կիրառությունների ավելի լայն ուղեցույցը բացատրում է, թե ինչպես են դիտարկումն ու պատրաստումը փոխկապակցվում։

Ընտրեք այն այլընտրանքը, որը պահպանում է ձեզ անհրաժեշտ չափումը։ Գույնը ստացված պատկերի հատկություններից միայն մեկն է։