Մեթիլեն կապույտը և տեսողությունը․ ինչ են ցույց տալիս ցանցաթաղանթի հետազոտությունները և որտեղ են դրանց սահմանները

Ընթերցողը գտնում է ուսումնասիրություն, որում մեթիլեն կապույտը պաշտպանել է ցանցաթաղանթը, և տալիս է բնական հարցը՝ արդյո՞ք այն պետք է կիրառել աչքում։ Մեթիլեն կապույտի և տեսողության վերաբերյալ հետազոտությունները չեն պատասխանում այդ հարցին, քանի որ առանցքային ուսումնասիրություններից ոչ մեկում այդ կիրառումը չի փորձարկվել։ Մի ուսումնասիրությունում ներկանյութը տոքսինի հետ ներարկել են մկների ապակենման մարմնի մեջ։ Մյուսում այն ավելացրել են անոթում մեկուսացված բջիջները շրջապատող միջավայրին։ Երրորդում այն ավելացրել են մուտանտ մկների խմելու ջրին։ Յուրաքանչյուր արդյունք վերաբերում է իր ներմուծման ուղուն և իր մոդելին։

Այս հոդվածը դիտարկում է երեք նախակլինիկական ուսումնասիրություն, ցանցաթաղանթի երկու բջջատեսակ և լաբորատոր պայմաններում պաշտպանության ու աչքի կլինիկական բուժման միջև սահմանը։ Ընդհանուր պատկերը հետևողական է․ վերահսկվող պայմաններում մեթիլեն կապույտը կարող է փոփոխել ցանցաթաղանթի բջիջների միտոքոնդրիալ սթրեսը, սակայն այդ արդյունքը չի հիմնավորում մանրածախ վաճառվող լուծույթներն աչքին կիրառելը։

Երկու բջջատեսակ, երկու տարբեր հիվանդություն

Ցանցաթաղանթն ունի շերտավոր կառուցվածք, և շերտի տեղադրությունը կարևոր է։ Լույսը նախ ընկնում է ցանցաթաղանթի արտաքին հատվածի լուսընկալիչների վրա։ Դրանց ազդանշանները միջանկյալ նեյրոններով փոխանցվում են ցանցաթաղանթի ներքին հատվածի գանգլիոնային բջիջներին, որոնց աքսոնները դուրս են գալիս տեսողական նյարդով։ Ստորև բերված գծապատկերում շերտերը նշված են հերթականությամբ։

Ցանցաթաղանթի գանգլիոնային բջիջներն այն բջիջներն են, որոնք վտանգվում են գլաուկոմայի և տեսողական նյարդի նյարդախտի դեպքում։ Երբ որոնումներում հիշատակվում են մեթիլեն կապույտն ու գլաուկոման, սովորաբար նկատի ունեն այս ներքին շերտն ու դրա աքսոնները։ Լուսընկալիչներն այն բջիջներն են, որոնք վտանգվում են ցանցաթաղանթի արտաքին հատվածի դեգեներացիայի դեպքում։ Ցանցաթաղանթում դրանք ունեն էներգիայի ամենաբարձր պահանջարկը և աշխատում են իրենց բջջային շնչառության հնարավորությունների սահմանին մոտ, ուստի միտոքոնդրիալ I համալիրի խափանման դեպքում քիչ պահուստ են ունենում։ Մեկ բջջատեսակում ստացված արդյունքը չի տարածվում մյուսի վրա, և ստորև ներկայացված երեք ուսումնասիրությունները դրանք դիտարկում են առանձին։ Մոդելները եզրակացություններից տարբերակելու ընդհանուր հմտությունը բացատրված է ինչպես կարդալ մեթիլեն կապույտի հետազոտությունները հոդվածում։

Գանգլիոնային բջիջները կենդանի մկան աչքում

Այս երեք ուսումնասիրություններից ամենավաղում հետազոտողները մոդելավորել են տեսողական նյարդի նյարդախտը՝ ռոտենոն միկրոներարկելով մկան մեկ աչքի ապակենման մարմնի մեջ, իսկ մյուս աչքում որպես հսկիչ ներարկել են միայն լուծիչը։ Ռոտենոնը արգելափակում է միտոքոնդրիալ I համալիրը՝ այն մուտքային օղակը, որը NADH-ից էլեկտրոնները փոխանցում է շղթայի հաջորդ բաղադրիչներին։ I համալիրի գործառույթի խանգարումը նաև այն հատկանիշն է, որն այս մոդելը կապում է Լեբերի ժառանգական տեսողական նյարդախտի՝ գանգլիոնային բջիջների և տեսողական նյարդի հիվանդության հետ։

Քսանչորս ժամ անց ռոտենոնով մշակված աչքերի գանգլիոնային բջիջների շերտն ավելի բարակ էր և ավելի քիչ բջիջներ էր պարունակում, քան հսկիչ աչքերինը։ Երբ մեթիլեն կապույտը ներարկվել է ռոտենոնի հետ միասին, այդ վնասումը կանխվել է դեղաչափից կախված կերպով․ փորձարկված ամենաբարձր դեղաչափը՝ 0.07 mg/kg, որը շատ ցածր էր մկների LD50-ից, պահպանել է թե՛ շերտի հաստությունը, թե՛ բջիջների քանակը։ Ուղեղի հոմոգենատներում զուգահեռ փորձարկումները ցույց են տվել երկու ազդեցություն․ մեթիլեն կապույտը հակադարձել է ռոտենոնով առաջացած օքսիդատիվ սթրեսը և թթվածնի սպառման անկումը։ Հեղինակներն առաջարկել են էքսցիտոտոքսիկ մեխանիզմ, որի դեպքում ռոտենոնը վնասում է կարգավորող ամակրինային բջիջները, գանգլիոնային բջիջներն առաջացնում են չափազանց շատ իմպուլսներ, իսկ հակաօքսիդանտային ազդեցությունն ընդհատում է դրանից առաջացող վնասումը։ Այդ պաշտպանության հիմքում առաջարկվող քիմիական գործընթացները մանրամասն ներկայացված են մեթիլեն կապույտի միտոքոնդրիալ մեխանիզմները հոդվածում։

Այս արդյունքն ունի երեք սահմանափակում։ Ներկանյութը տոքսինի հետ միասին ներարկվել է անմիջապես աչքի մեջ, ինչը ներմուծման եղանակ է, ոչ թե բուժման սխեմա։ Դիտարկման ժամանակահատվածը 24 ժամ էր։ Եվ ցիտոքրոմ օքսիդազի չափված ցուցանիշներն աճել են երկու վնասված խմբերում էլ, ինչը հեղինակները մեկնաբանել են որպես գերակտիվություն, ոչ թե կենդանի ցանցաթաղանթում շնչառության վերականգնման ապացույց։

Անոթում մեկուսացված գանգլիոնային բջիջները

Երկրորդ ուսումնասիրությունում աչքն ընդհանրապես չի օգտագործվել։ Հետազոտողները երիտասարդ առնետներից մեկուսացրել են ցանցաթաղանթի առաջնային գանգլիոնային բջիջներ և դրանք ենթարկել ռոտենոնի, ապոպտոզ առաջացնող ստաուրոսպորինի կամ 72 ժամ տևող թթվածնի ցածր մակարդակի ազդեցությանը, ապա կենդանի և մահացած բջիջները տարբերակող ներկմամբ չափել են կենսունակությունը։ Կուլտուրայի միջավայրում 1 և 10 micromolar կոնցենտրացիաներով մեթիլեն կապույտը բարելավել է կենսունակությունը յուրաքանչյուր վնասող ազդեցության դեպքում՝ մոտավորապես 1.5-ից 1.9 անգամ՝ կախված պայմաններից։ Ուղեկցող փորձարկումը ցույց է տվել, որ ջրածնի պերօքսիդի ազդեցության ընթացքում մեթիլեն կապույտը պահպանել է ցիտոքրոմ c օքսիդազի ակտիվությունը։

Սա մեկուսացված բջիջների դեղաբանություն է։ Միացությունը բջիջներին հասել է կուլտուրայի միջավայրով դիֆուզիայի միջոցով՝ սահմանված կոնցենտրացիայով, առանց ճանապարհին եղջերաթաղանթի, արցունքային թաղանթի, ոսպնյակի, ապակենման մարմնի, արյունամատակարարման կամ իմունային համակարգի առկայության։ Հենց այդ պարզությունն է մոդելի իմաստը․ այն ցույց է տալիս, որ գանգլիոնային բջիջներն իրենք կարող են պաշտպանվել, երբ միացությունը հասնում է դրանց։ Այն ոչինչ չի ասում այն մասին, թե եղջերաթաղանթի մակերեսին դրված կաթիլը կարո՞ղ է որևէ սահմանված կոնցենտրացիա հասցնել ցանցաթաղանթի ներքին հատված։ 10 micromolar-ից բարձր կոնցենտրացիաներից խուսափել են նույն բջիջների համար թունավորության պատճառով․ սա հիշեցնում է, որ անոթում դեղաչափից կախված արձագանքը կարող է լինել թե՛ օգտակար, թե՛ վնասակար։

Լուսընկալիչները մուտանտ մկներում և բջջային գծում

Երրորդ ուսումնասիրությունը վերաբերում է ցանցաթաղանթի արտաքին հատվածին։ Հետազոտողներն օգտագործել են Harlequin մկներ, որոնք ունեն ապոպտոզ առաջացնող գործոնի պակաս, ինչի պատճառով I համալիրը մնում է ոչ լիարժեք հավաքված, և 11 ամսական հասակում ուսումնասիրել են լուսընկալիչների կառուցվածքը, արտաքին հատվածների մարկերներն ու միտոքոնդրիաների ամբողջականությունը։ Կրծքից կտրելուց հետո մեթիլեն կապույտը տրվել է համակարգային կերպով՝ խմելու ջրի մեջ, օրական մոտ 10 mg/kg չափով։ Այն ստացած մուտանտ մկների մոտ ցանցաթաղանթի հաստությունն ավելի լավ էր պահպանված, ռոդոպսինի և օպսինի մարկերներն ավելի շատ էին, իսկ միտոքոնդրիալ կառուցվածքն ավելի առողջ էր, քան այն չստացած մուտանտների մոտ։

Ուղեկցող բջջային աշխատանքում օգտագործվել են 661W բջիջներ՝ մկների լուսընկալիչանման անմահացված բջջային գիծ, որոնք 24 ժամ ենթարկվել են ռոտենոնի ազդեցությանը՝ մեթիլեն կապույտով կամ առանց դրա։ Կենսունակությունը բարելավվել է 30 micromolar կոնցենտրացիայի դեպքում, իսկ ավելի ցածր կոնցենտրացիաները կարգավորել են NADH-ի և NAD+-ի հարաբերակցությունն ու նվազեցրել օքսիդատիվ սթրեսը։ Ուշագրավն այն է, թե ինչ չի արել մեթիլեն կապույտը․ այն չի վերականգնել ATP-ն։ Պաշտպանությունը կապված էր օքսիդավերականգնման սթրեսի թեթևացման և սթրեսային ուղիների ակտիվության նվազման հետ, ներառյալ միտոքոնդրիալ չծալված սպիտակուցների պատասխանը և միտոֆագիայի մարկերները, այլ ոչ թե էներգամատակարարման վերականգնման։

Այս տարբերությունը կարևոր է մեթիլեն կապույտի և ցանցաթաղանթի վերաբերյալ պնդումների համար։ Միացությունը կարող է սթրեսի ենթարկված լուսընկալիչը կենդանի պահել՝ առանց շտկելու դրա էներգետիկ պակասը, ինչը հնարավոր բուժական մեկնաբանությունը սահմանափակում է օքսիդավերականգնման սթրեսով, այլ ոչ թե լայնածավալ երիտասարդացմամբ։

Երեք ուսումնասիրությունների համադրությունը

Ստորև բերված համեմատությունում յուրաքանչյուր ուսումնասիրության համար նշված են մոդելն ու ներմուծման ուղին, քանի որ հենց այդ երկու սյունակներն են որոշում, թե արդյունքն ինչ կարող է հիմնավորել։

Յուրաքանչյուր տող վերաբերում է նախակլինիկական ուսումնասիրության։ Ոչ մեկում չեն ներգրավվել հիվանդներ, չի չափվել տեսողությունը և չի փորձարկվել ակնաբուժական պատրաստուկ։

Ինչու սա գլաուկոմայի բուժում չէ

Գլաուկոմայի բուժումն իջեցնում է ներակնային ճնշումը։ Նյարդապաշտպանությունն այլ նպատակ է հետապնդում՝ սթրեսի պայմաններում կենդանի պահել գանգլիոնային բջիջներն ու դրանց աքսոնները։ Վերը ներկայացված ուսումնասիրությունները վերաբերում են երկրորդ նպատակին, ոչ թե առաջինին։ Դրանցից ոչ մեկում ճնշումը չի իջեցվել, և ոչ մեկում մեթիլեն կապույտը չի համեմատվել ճնշումն իջեցնող բուժման հետ։ Ահա թե ինչու գլաուկոմայի բուժման և ճնշման վերահսկման ընդունված մոտեցումները մնում են օքսիդավերականգնման նյարդապաշտպանությունից առանձին հարց, և ինչու բջիջների կենսունակության արդյունքը չի կարելի մեկնաբանել որպես պահպանված տեսողություն։

Ներմուծման ուղիների տարբերություններն ընդգծում են այս միտքը։ Ներապակենման համատեղ ներարկումը հայտնի քանակ է հասցնում ցանցաթաղանթի կողքին՝ վնասման պահին։ Խմելու ջրով ներմուծումն ամբողջ կենդանուն ամիսներ շարունակ ենթարկում է միացության ազդեցությանը՝ ցանցաթաղանթում անհայտ կոնցենտրացիայով։ Կուլտուրայի միջավայրը միացությանն անմիջականորեն հասանելի է դարձնում մեկուսացված բջիջները։ Սրանցից ոչ մեկը չի կանխատեսում, թե տեղային դեղաչափի որ մասն է անցնելու եղջերաթաղանթով, խուսափելու արցունքներով հեռացումից, անցնելու ոսպնյակի և ապակենման մարմնի միջով ու օգտակար կոնցենտրացիայով հասնելու ցանցաթաղանթի որևէ շերտի։ Հասցման այս խնդիրը մեթիլեն կապույտի ներմուծման ուղիների և բաշխման ավելի լայն հարցի մաս է, որտեղ յուրաքանչյուր ուղու համար անհրաժեշտ են կոնցենտրացիայի առանձին չափումներ։

Հյուսվածքային տարբերությունները երկրորդ խոչընդոտն են։ Աչքի առջևի հատված հասած ներկանյութը դեռ չի հասել դրա հետևի հատվածին, իսկ մի շերտին օգնող կոնցենտրացիան կարող է վնասել մյուսը։ Մանրածախ վաճառվող լուծույթները չեն արտադրվում, ստերիլացվում, բուֆերացվում կամ կոնսերվացվում որպես ակնաբուժական պատրաստուկներ, իսկ մաքրությունը, pH-ը, օսմոլալությունն ու օժանդակ նյութերը կարևոր են թե՛ եղջերաթաղանթի, թե՛ ներակնային ազդեցության համար։ Ցանցաթաղանթի վերաբերյալ այս արդյունքներից ոչ մեկը չի հիմնավորում նման լուծույթներն աչքի մեջ կամ դրա մակերեսին կիրառելը։ Պատրաստուկների չափանիշների վերաբերյալ հարցերը պետք է դիտարկել մեթիլեն կապույտի անվտանգության և դրա հետ աշխատանքի կանոնների շրջանակում։

Որտեղ են ավարտվում ապացույցները

Միասին դիտարկվելիս այս երեք աշխատանքները հիմնավորում են սահմանափակ պնդում․ վերահսկվող պայմաններում մեթիլեն կապույտը կարող է թեթևացնել ցանցաթաղանթի նեյրոնների միտոքոնդրիալ օքսիդավերականգնման սթրեսը և պահպանել դրանց կառուցվածքը։ Պնդման կիրառելիությունն ավարտվում է այնտեղ, որտեղ ավարտվում են այդ պայմանները։ Տոքսինային և I համալիրի գենետիկ մոդելները գլաուկոմա, դրուզներ կամ դիաբետիկ հիվանդություն չեն։ Կարճ դիտարկման ժամանակահատվածներն ու կառուցվածքային վերջնակետերը երկարատև պահպանված տեսողություն չեն։ Իսկ մեկ հատվածում պաշտպանող կոնցենտրացիան մեկ այլ հատվածի համար դեղաչափ չէ։

Ավելի հիմնավոր եզրակացության համար անհրաժեշտ կլինեն առանձին բաղադրիչներ՝ կլինիկապես կիրառելի ուղիով ներմուծումից հետո ցանցաթաղանթի ազդեցության սահմանված մակարդակ, կենդանիների տեսողության գործառութային վերջնակետեր, գլաուկոմային համապատասխան մոդելում ճնշումից անկախ օգուտ, ապա՝ մարդկանց մոտ անվտանգության և արդյունավետության տվյալներ։ Մինչև դրանց առկայությունը մեթիլեն կապույտի և տեսողության կապը մնում է հստակ սահմաններով հետազոտական վարկած․ ցանցաթաղանթում հավանական միտոքոնդրիալ դեղաբանական ազդեցություն, որը ցուցադրվել է միայն բջիջներում և կենդանիներում, և այս ուսումնասիրություններից դեպի աչքի բուժում տանող ուղու բացակայություն։