Կարո՞ղ է մեթիլեն կապույտը շրջանցել միտոքոնդրիալ III համալիրը։ Ինչու են հետազոտությունները հակասում իրար

Երկու լաբորատորիա ուսումնասիրել են՝ արդյոք մեթիլեն կապույտը կարող է շրջանցել արգելակված միտոքոնդրիալ III համալիրը։ Մեկը պատասխանել է՝ ոչ։ Մյուսը՝ այո։ Երկուսն էլ տվյալներ ունեին։

Առաջին հետազոտությունը՝ մկան ուղեղի միտոքոնդրիաներով, պարզել է, որ ներկանյութը չի կարող դա անել։ Երկրորդը՝ կրծողների երեք տեսակների ուղեղի միտոքոնդրիաներով, պարզել է, որ այն մասամբ կարող է։ Երրորդ հետազոտությունը՝ մկան լյարդով, հաճախ հիշատակվում է դրանց կողքին, բայց ուսումնասիրել է այլ հարց։ Եթե այն դիտարկենք իր իրական շրջանակում, շփոթության կեսը կվերանա։

Այստեղ չկա համընդհանուր մեխանիզմ, որի մասին կարելի է հայտարարել։ Կան երեք փորձեր՝ տարբեր արգելակիչներով, դոզաներով և չափվող ցուցանիշներով։ Նախ ուսումնասիրեք պայմանները։ Եզրակացությունները բխում են դրանցից։

Ինչ է այստեղ նշանակում շրջանցումը

Էլեկտրոնները շղթա են մտնում I համալիրով՝ NADH-ից, կամ II համալիրով՝ սուկցինատից, III համալիրով անցնում դեպի ցիտոքրոմ c, ապա IV համալիրով՝ դեպի թթվածին։ Այդ ընթացքում ձևավորված գրադիենտն է, որ բջիջն օգտագործում է ATP արտադրելու համար։

Շրջանցման մասին պնդումը նշանակում է, որ մեթիլեն կապույտը էլեկտրոններ է վերցնում արգելակման կետից առաջ և փոխանցում այդ կետից հետո։ Օքսիդացված ներկանյութն էլեկտրոններ է վերցնում NADH-ից կամ շղթայի սկզբնական բաղադրիչներից՝ վերածվելով լեյկոմեթիլեն կապույտի, իսկ վերականգնված ձևը դրանք փոխանցում է ցիտոքրոմ c-ին կամ վերադարձնում շղթա։ Եթե փոխանցումը տեղի է ունենում արգելակման կետից հետո, շնչառությունն ու թաղանթային պոտենցիալը մասամբ վերականգնվում են։ Եթե այն տեղի է ունենում հենց արգելակման կետում կամ դրանից առաջ, վերականգնում չի լինում։

III համալիրի մեկ առանձնահատկությունը մեծապես որոշում է այս վեճի ընթացքը։ Համալիրն իրականացնում է Q ցիկլ՝ արգելակիչների կապման երկու տեղամասով։ Անտիմիցինը կապվում է Qi տեղամասին։ Միքսոթիազոլը կապվում է Qo տեղամասին։ Դրանցից միայն մեկն օգտագործող հետազոտությունն ուսումնասիրել է համալիրի միայն կեսը։

Առաջին հետազոտությունը․ մկան ուղեղի միտոքոնդրիաներում շրջանցում չկա

Գուրեևն ու գործընկերներն օգտագործել են C57BL/6 մկների ուղեղի կեղևի միտոքոնդրիաներ՝ մեկուսացված դիգիտոնինով, որոնք ուսումնասիրվել են 0.1 mg per ml սպիտակուցի կոնցենտրացիայով։ Սուբստրատներն ընդգրկել են երեք տարբերակ՝ պիրուվատ և մալատ՝ յուրաքանչյուրը 5 mM, սուկցինատ՝ 10 mM, գլուտամատի հետ՝ 2 mM, և L-պրոլին՝ 10 mM։ Արգելակիչներն էին ռոտենոնը՝ 1 micromolar կոնցենտրացիայով՝ I համալիրի համար, և անտիմիցինը՝ 1 microgram per ml կոնցենտրացիայով՝ III համալիրի համար։ Ներկանյութի դոզաներն էին 0.5, 1 և 2 micromolar, իսկ հիմնական կոնցենտրացիան՝ 1 micromolar։ Մեթոդներն ու գրանցված կորերը ներկայացված են FEBS Letters-ի հաղորդման մեջ։

I համալիրի շրջանցումն աշխատել է։ Ռոտենոնը ADP-ով խթանված շնչառությունը մոտ 121-ից նվազեցրել է մինչև մոտ 2 nmol per minute per mg, իսկ 1 micromolar ներկանյութն այն վերականգնել է մինչև մոտ 21։ Թաղանթային պոտենցիալը վերականգնվել է պիրուվատ–մալատ և L-պրոլին սուբստրատների դեպքում։

III համալիրի շրջանցումը չի աշխատել։ Անտիմիցինը շնչառությունը նվազեցրել է մինչև մոտ 16, իսկ ներկանյութն այն բարձրացրել է միայն մինչև մոտ 20։ Թաղանթային պոտենցիալը չի վերականգնվել որևէ սուբստրատի դեպքում՝ նույնիսկ ներկանյութի մինչև 5 micromolar դոզաներով։ Պերօքսիդի տվյալները նույնպես հուշել են նույնը․ միայն ներկանյութը պերօքսիդի արտազատումը մոտ 76 pmol per minute per mg ելակետային արագությունից բարձրացրել է մինչև մոտավորապես 1170, 1460 և 1945՝ երեք դոզաների դեպքում, սակայն անտիմիցինը ներկանյութով պայմանավորված այդ ազդանշանը նվազեցրել է համապատասխանաբար մոտ 25, 88 և 96 տոկոսով։ Եթե վերականգնված ներկանյութն անմիջապես արձագանքեր թթվածնի հետ, III համալիրի արգելակումը չպետք է ճնշեր ազդանշանը։ Հեղինակները եզրակացրել են, որ վերականգնված ներկանյութն օքսիդանում է III համալիրի Qo տեղամասում՝ անտիմիցինով արգելակման կետից առաջ։ Կարճ օղակը՝ բառերով․ դոնորներից դեպի ներկանյութ, ներկանյութից դեպի Qo, այնուհետև՝ սովորական ուղով։ Ռոտենոնի ազդեցությունը շրջանցվում է։ Անտիմիցինինը՝ ոչ։

Երկրորդ հետազոտությունը․ մասնակի շրջանցում երեք տեսակներում՝ արգելակիչների կապման երկու տեղամասերում էլ

Շվաբն ու գործընկերներն ընդլայնել են փորձի սխեման։ Մկների, առնետների և ծովախոզուկների ուղեղի միտոքոնդրիաները մեկուսացվել են Percoll-ով և ուսումնասիրվել նույն՝ 0.1 mg per ml կոնցենտրացիայով՝ պիրուվատ–մալատ կամ գլուտամատ–մալատ սուբստրատներով՝ յուրաքանչյուրը 5 mM։ Նրանք օգտագործել են III համալիրի երկու արգելակիչ՝ անտիմիցին A՝ 0.3 micromolar, և միքսոթիազոլ՝ 1 micromolar։ Ներկանյութի կոնցենտրացիան փորձերի մեծ մասում եղել է 2 micromolar, իսկ ցիտոքրոմ c-ի հետ աշխատանքում՝ 0.5։ Համադրելի արձանագրություններով ուսումնասիրված բոլոր երեք տեսակները ներկայացված են բաց հասանելիությամբ հոդվածում։

Երկու արգելակումներն էլ մասամբ շրջանցվել են բոլոր երեք տեսակներում։ Մկան միտոքոնդրիաներում անտիմիցինը ճնշել է շնչառությունը, իսկ ներկանյութն այն բարձրացրել է մոտ 60 տոկոսով՝ մոտավորապես 37-ից մինչև 59 nmol per minute per mg։ Միքսոթիազոլն այն ճնշել է 88 տոկոսով՝ մինչև մոտ 4.5, իսկ ներկանյութն այն բարձրացրել է հնգապատիկ՝ մինչև մոտ 23։ Երկու արգելակիչների դեպքում էլ թաղանթային պոտենցիալը մասամբ վերականգնվել է։ Այն չափվել է երկու ներկանյութով՝ սաֆրանին O-ով և հարաբերաչափական TMRM-ով՝ օպտիկական արտեֆակտները բացառելու համար։

Այս աշխատանքը նաև ուղղակիորեն փորձարկել է էլեկտրոնների փոխանցումը, ինչը առաջին հետազոտությունը չէր արել։ Արտածին ացետիլացված ցիտոքրոմ c-ն՝ 25 micromolar կոնցենտրացիայով, էներգիայով ապահովված միտոքոնդրիաների կողմից չէր վերականգնվում՝ ո՛չ արգելակիչների առկայությամբ, ո՛չ առանց դրանց, սակայն ներկանյութի ավելացումը երկու դեպքում էլ առաջացրել է վերականգնում։ Բջիջներ չպարունակող բուֆերում NADH-ն ու ներկանյութը վերականգնել են ցիտոքրոմ c-ն՝ NADH-ի քանակին համեմատական արագությամբ։ Ավելի երկար ցատկը՝ բառերով․ վերականգնող համարժեքներից դեպի ներկանյութ, ներկանյութից անմիջապես դեպի ցիտոքրոմ c, ապա IV համալիրով՝ դեպի թթվածին։ Այդ ուղին ամբողջությամբ բաց է թողնում III համալիրը, ուստի երկու արգելակիչների ազդեցությունն էլ կարող է շրջանցվել։

Երկու լրացուցիչ ցուցանիշ հաստատում են այդ մեկնաբանությունը։ NAD(P)H-ի ֆլուորեսցենցիան նվազել է, երբ ներկանյութն ավելացվել է միքսոթիազոլով մշակված միտոքոնդրիաներին․ սա նշանակում է, որ վերականգնող համարժեքները ծախսվել են նոր ուղու միջոցով։ Իսկ ներկանյութի կլանումը 660 nm-ում արտացոլել է յուրաքանչյուր հաջորդական ավելացումը, մինչդեռ ցենտրիֆուգումից հետո ստացված վերնահեղուկները ցույց են տվել, որ օքսիդացված ներկանյութն էներգիայով ապահովված միտոքոնդրիաներում կուտակվում է ավելի քան հարյուրապատիկ, ապա դուրս է գալիս, երբ պոտենցիալը կտրուկ անկում է ապրում։ Պրոտոնների հաշվեկշիռը նույնպես համապատասխանում է․ պրոտոնների մղման փուլերը բաց թողնելու դեպքում էլեկտրոնների յուրաքանչյուր զույգի հաշվով մնում է մոտավորապես 2 պրոտոն՝ 10-ի փոխարեն, ուստի թթվածնի ավելի արագ օգտագործումը՝ միայն մասնակի վերաբևեռացմամբ, իրական շրջանցման դրսևորում է, ոչ թե դրա դեմ ապացույց։

Նույն պատրաստուկը տվել է արդյունքներ, որոնք հեշտ է սխալ մեկնաբանել մակերեսային ընթերցման դեպքում։ Արգելակիչի և ներկանյութի առկայությամբ ADP-ն իջեցրել է շնչառությունը՝ բարձրացնելու փոխարեն, իսկ փոխադրման արգելակումն այն խթանել է՝ դանդաղեցնելու փոխարեն, մինչդեռ թաղանթային պոտենցիալը դեռ փոփոխվել է սովորական ուղղություններով։ Այս համակարգում միայն թթվածնի սպառումը մոլորեցնում է։

Երրորդ հետազոտությունը․ լյարդի ուսումնասիրությունը, որը փորձարկել է I և II համալիրները, ոչ թե III-ը

Լին և Բյոլստերլին օգտագործել են մկան լյարդի միտոքոնդրիաներ և բջջային կուլտուրայում աճեցված հեպատոցիտներ, որոնք վնասվել էին էֆավիրենցով՝ I համալիրի համար IC50-ը մոտ 30 micromolar, և հիդրազինով՝ իզոնիազիդի մետաբոլիտով՝ II համալիրի համար IC50-ը մոտ 30 micromolar։ Մոտ 30 micromolar ներկանյութը վերականգնել է NADH-ի օքսիդացումը, թաղանթային պոտենցիալն ու ATP-ն՝ միաժամանակ նվազեցնելով օքսիդանտներն ու նեկրոտիկ մահը։ Redox Biology-ի հոդվածը դա ներկայացնում է որպես ներկանյութով էլեկտրոնների տեղափոխում՝ վնասված I և II համալիրները շրջանցելով։

Այդ արդյունքը հաստատված նախնական համատեքստ է շղթայի ավելի վաղ հատվածի համար և ոչինչ չի ասում III համալիրի մասին, քանի որ այդ հետազոտությունում այնտեղ ոչինչ չէր արգելակվել։ Այն չի կարող հաստատել կամ հերքել ուղեղի երկու հետազոտություններից որևէ մեկը։

Պայմանների մատրիցը

Չորս պատճառ, թե ինչու III համալիրի երկու հետազոտություններն էլ կարող են ճիշտ լինել իրենց պայմաններում

1. Արգելակիչներով միջամտությունները նույնը չէին։ Միայն անտիմիցին՝ 1 microgram per ml, համեմատվել է 0.3 micromolar անտիմիցինի և առանձին Qo տեղամասի արգելակիչի հետ։ Ներկանյութի այն ուղին, որը սնուցում է Qo տեղամասը, ձախողվում է հենց այնտեղ, որտեղ ցիտոքրոմ c-ին անմիջապես փոխանցող ուղին հաջողվում է։ Մեկ տեղամասը չի կարող ներկայացնել երկուսն էլ։

2. Ներկանյութի դոզան և ժամանակացույցը տարբեր էին։ Հիմնական կոնցենտրացիաները եղել են 1 և 2 micromolar՝ օքսիդավերականգնման ցիկլերով գործող նյութի համար, որի կլանումն ու ցիտոքրոմ c-ի ուղղակի վերականգնումը կախված են կոնցենտրացիայից և ժամանակից։ Դոզաների փոքր տարբերությունները՝ չափումների տարբեր ժամանակների հետ միասին, կարող են բացահայտել նույն ցանցի տարբեր ճյուղեր։

3. Պատրաստուկները տարբեր էին։ Դիգիտոնինով մեկուսացումը և Percoll-ի գրադիենտով մեկուսացումն առանձնացնում են համընկնող, բայց ոչ նույնական միտոքոնդրիալ պոպուլյացիաներ։ Սպիտակուցի կոնցենտրացիան նույնն էր՝ 0.1 mg per ml, ուստի այդ փոփոխականը բացառվում է, բայց ենթապոպուլյացիայի և ամբողջականության տարբերությունները՝ ոչ։ Իսկ տեսակի տարբերության կասկածը փարատվել է․ երկրորդ խումբն իր դիտարկած պատկերը վերարտադրել է նաև մկների մոտ։

4. Սուբստրատային պայմանները որոշում են ներկանյութի հնարավորությունները։ Երեք սուբստրատային տարբերակներ՝ համեմատած NADH-ի հետ կապված զույգերի հետ։ NADH-ի մատակարարումն ու թաղանթային պոտենցիալը համատեղ որոշում են, թե որքան արագ է ներկանյութը վերականգնվում և որտեղ է այն բաշխվում։ Իսկ այն ուղին, որին անհրաժեշտ է վերականգնված ներկանյութ՝ օքսիդացված ցիտոքրոմ c-ի կողքին, կախված է այդ ընտրությունից։

Ինչպես գնահատել շրջանցման մասին հաջորդ պնդումը

Հարցրեք՝ որ համալիրն է արգելակվել, ինչ արգելակիչով, որ տեղամասում և ինչ դոզայով։ Հարցրեք ներկանյութի կոնցենտրացիան և չափման ժամանակը։ Հարցրեք հյուսվածքը, տեսակը, մեկուսացման եղանակը, սպիտակուցի կոնցենտրացիան և սուբստրատը։ Եվ հարցրեք՝ արդյոք պոտենցիալի, շնչառության, օքսիդավերականգնման վիճակի և ուղղակի փոխանցման փորձի արդյունքները համընկնում են, որովհետև այստեղ միայն թթվածնի սպառումը մեկից ավելի անգամ սխալ ուղղություն է հուշել։

Սահմանափակ եզրակացությունն ուժի մեջ է։ Ներկանյութով I համալիրի շրջանցման հարցում համաձայնություն կա։ III համալիրի դեպքում մկան միտոքոնդրիաները՝ անտիմիցինով 1 microgram per ml և ներկանյութով 1 micromolar կոնցենտրացիաներում, գործառութային շրջանցում չեն ցուցաբերում, մինչդեռ երեք տեսակները՝ անտիմիցինով 0.3 micromolar կամ միքսոթիազոլով 1 micromolar և ներկանյութով 2 micromolar կոնցենտրացիաներում, ցուցաբերում են մասնակի շրջանցում՝ ներկանյութից ցիտոքրոմ c ուղղակի փոխանցմամբ։ Այս պնդումները համատեղելի են։ Ավելի լայն ցանկացած եզրակացություն էքստրապոլյացիա է։

Հարակից ընթերցանությունը վիճելի պնդումը պահում է հաստատված քիմիայի շրջանակում․ ինչպես է մեթիլեն կապույտը տեղափոխում էլեկտրոնները՝ փոխանցման շղթայի մասին, I համալիրի շրջանցման փորձերը՝ շղթայի ավելի վաղ հատվածում հաստատված դեպքի մասին, թաղանթային պոտենցիալի չափումներն ու դրանց արտեֆակտները՝ այն մասին, թե ինչու էին անհրաժեշտ երկու ներկանյութ, և օքսիդավերականգնման ցիկլերով գործող նյութերի հետ լաբորատոր աշխատանքը՝ դոզավորման ու ժամանակացույցի թակարդների մասին։