Հոդված
Մեթիլեն կապույտը և բջջային ծերացումը․ ինչ են չափում ֆիբրոբլաստների փորձերը
Տարածված սխալ մեկնաբանությունը հետևյալն է։ Հոդվածում հաղորդվում է, որ մեթիլեն կապույտը կուլտիվացվող ֆիբրոբլաստներին ավելացրել է պոպուլյացիայի ավելի քան 20 կրկնապատկում, ուստի ընթերցողը եզրակացնում է, որ այն հեռացնում է ծերացած բջիջները կամ նույն չափով երկարացնում մարդու կյանքի տևողությունը։ Այս եզրահանգումը բնական է թվում։ Սակայն այն սխալ է երկու առանձին առումներով։
Հիմքում ընկած խնդիրը հասկացութային է, ոչ թե թվային։ Պոպուլյացիայի կրկնապատկումները, ծերացման մարկերները և տելոմերների չափումները պատասխանում են տարբեր հարցերի։ Ֆիբրոբլաստների վրա մեթիլեն կապույտի վերաբերյալ աշխատանքները լավագույնս պետք է ընկալել որպես լաբորատոր ամանում մեկ տեսակի բջիջների ծերացման անցումը հետաձգելու ուսումնասիրություն՝ հիմնավորված միտոքոնդրիալ չափումներով։ Սա տարբերվում է արդեն ծերացած բջիջների ընտրողական հեռացումից և, իր հերթին, օրգանիզմի ծերացումից։ Այս տարբերակման ավելի լայն համատեքստը կապված է միտոքոնդրիալ էլեկտրոնների փոխադրման՝ բջջի էներգետիկան ձևավորելու եղանակի և մեթիլեն կապույտի հետազոտական պնդումները մեկնաբանելու հետ։
Պոպուլյացիայի կրկնապատկումները հաշվում են անցած պատմությունը, ոչ թե երիտասարդությունը
Հիմնական արդյունքների մեծ մասը ստացվել է IMR90 բջիջներից՝ մարդու պտղի թոքի նորմալ ֆիբրոբլաստների գծից, որն ունի բազմացման սահմանափակ կարողություն։ IMR90 ֆիբրոբլաստներում մեթիլեն կապույտի և ռեպլիկատիվ կյանքի տևողության վաղ ուսումնասիրությունում կուլտուրաները վերացանվում էին ըստ ժամանակացույցի, և պոպուլյացիայի կուտակային կրկնապատկումները գրանցվում էին մինչև կուլտուրայի բաժանման դադարումը։ Նանոմոլային մակարդակներով մշակումը՝ հիմնականում 100 nM խտությամբ, թույլ տվեց կուլտուրաներին մինչև բաժանման կանգը կուտակել ավելի քան 20 լրացուցիչ կրկնապատկում։
Պոպուլյացիայի կրկնապատկումը հաշվառման միավոր է։ Այն գրանցում է, թե պոպուլյացիան մոտավորապես քանի անգամ է կրկնապատկվել։ Այն ուղղակիորեն չի ցույց տալիս՝ առանձին բջիջը ծերացած է, հանգստի վիճակում է, տարբերակված է, թե մահացած։ Կուլտուրան կարող է ավելի շատ կրկնապատկումներ ունենալ, որովհետև բջիջներն ավելի երկար են պահպանում բաժանվելու կարողությունը, որովհետև սթրեսի պայմաններում ավելի քիչ բջիջներ են վաղ դադարեցնում բաժանումը, կամ որովհետև պայմանները նպաստում են բազմացող ենթապոպուլյացիայի ընտրությանը։ Միայն հաշվարկը չի կարող տարբերակել այս ուղիները։
Այդ պատճառով կրկնապատկումների հաշվարկները համադրվում են մարկերների հետ։ Հաշվարկը ցույց է տալիս, թե որքան երկար է շարունակվել բազմացումը։ Մարկերները ցույց են տալիս, թե ինչ վիճակի են անցել բաժանումը դադարեցրած կամ գոյատևած բջիջները։
Գնահատման ցուցանիշների ուղեցույց․ ինչ է ցույց տալիս յուրաքանչյուր մարկերը
Կուլտուրայում ծերացումը ֆենոտիպ է, որը որոշվում է մի քանի անկախ չափումներով։ Ոչ մի առանձին ներկում կամ սպիտակուց չի ապացուցում այն։
Աճի կանգ՝ ԴՆԹ-ի սինթեզի կորստով։ Կայուն կանգը ստուգվում է BrdU-ի կամ EdU-ի ներգրավման նվազմամբ, հարթ մորֆոլոգիայով և վերացանումից հետո աճը վերսկսելու անկարողությամբ։ Սա տարբերակում է ծերացմամբ պայմանավորված կանգը ժամանակավոր հանգստի վիճակից։
Ծերացման հետ կապված բետա-գալակտոզիդազ։ SA-beta-gal ներկումը ցույց է տալիս լիզոսոմային ակտիվությունը pH 6.0-ի մոտ։ Ծերացած ֆիբրոբլաստները հաճախ դրական են ներկվում, երբ լիզոսոմների զանգվածն աճում է։ Այն յուրահատուկ չէ միայն ծերացմանը, ուստի մեկնաբանվում է բազմացման և մոլեկուլային մարկերների հետ միասին։
p16-ի և p21-ի ուղիները։ p16-ը գործում է CDK4-ի և CDK6-ի ու RB ուղու միջոցով։ p21-ը հաճախ ինդուկցվում է p53-ի միջոցով։ Դրանց մակարդակների բարձրացումը աջակցում է կանգի առկայության մասին եզրակացությանը, սակայն այս սպիտակուցներից ոչ մեկը հատուկ չէ միայն ծերացմանը։
Սեկրետոր վիճակ։ Ծերացման հետ կապված սեկրետոր ֆենոտիպը՝ SASP-ը, վերաբերում է ցիտոկինների, քեմոկինների, աճի գործոնների և պրոտեազների փոփոխված արտազատմանը։ SASP գործոնների ՌՆԹ-ի կամ սպիտակուցների վերլուծությունները նկարագրում են, թե ինչպես են բջիջներն ազդանշաններ փոխանցում հարևան բջիջներին։ Դրանք ուղղակիորեն չեն չափում բազմացման կարողությունը։
Օքսիդանտներ և միտոքոնդրիալ ցուցանիշներ։ Մեթիլեն կապույտի վերաբերյալ հոդվածներն ավելացնում են միտոքոնդրիալ չափումների շերտ՝ IV համալիրի քանակն ու ակտիվությունը, թթվածնի սպառումը, հեմի սինթեզը, թաղանթի զանգվածը, թաղանթային պոտենցիալը, ATP-ն և օքսիդանտների ազդանշանները։ Դրանք նկարագրում են նյութափոխանակային վիճակը, որն ուղեկցում է բաժանման կանգի հետաձգմանը։ Ինքնին դրանք չեն սահմանում ծերացումը, բայց ստուգում են առաջարկվող մեխանիզմը։ Օքսիդավերականգնման ցիկլի մոդելը, որում NAD(P)H-ը վերականգնում է մեթիլեն կապույտը, իսկ ցիտոքրոմ c-ն այն կրկին օքսիդացնում է, ներկայացված է նույն IMR90 ուսումնասիրությունում, որը օքսիդավերականգնման ցիկլը կապում է օքսիդանտների ավելի ցածր արտադրության հետ։ Դեղաչափման և բաշխման հարակից տրամաբանությունը ներկայացված է մեթիլեն կապույտի դեղաբանության և հյուսվածքների ազդեցության վերաբերյալ նյութերում։
Տելոմերների կարճացման արագություն։ Ճիշտ միավորը շաբաթների ընթացքում յուրաքանչյուր կրկնապատկման հաշվով կորցրած հիմքերի զույգերի քանակն է, ոչ թե մեկ ժամանակային կետում չափված երկարությունը։ Ավելի դանդաղ կարճացումը նշանակում է յուրաքանչյուր ռեպլիկացիայի հաշվով ավելի քիչ կարճացում։ Դա չի նշանակում երկարացում, իսկ սթրեսը կարող է կանգնեցնել IMR90 բջիջների բաժանումը՝ տելոմերների փոքր փոփոխությամբ։
Ֆիբրոբլաստների երեք փորձարարական սխեմաների համեմատություն
Այս էջի համար ստեղծված հիմնական նյութը ստորև ներկայացված համեմատությունն է։ Այն մեկ տեսադաշտում համադրում է բջջի տեսակը, ազդեցությունը, չափումը և սահմանափակումը։
| Ուսումնասիրություն | Բջիջներ և ազդեցություն | Ինչ է չափվել | Ինչ չի կարող ցույց տալ |
|---|---|---|---|
| Atamna և համահեղինակներ, FASEB J 2008 | Նորմալ IMR90 ֆիբրոբլաստներ, մեթիլեն կապույտի երկարատև նանոմոլային ազդեցություն, 100 nM՝ որպես ստանդարտ պայման | Կուտակային կրկնապատկումներ, IV համալիրի պարունակություն, թթվածնի սպառման աճ՝ 37-ից 70 տոկոս, հեմի սինթեզ, ջրածնի պերօքսիդով կամ կադմիումով հարուցված վաղաժամ ծերացման մեղմացում, 2-րդ փուլի ֆերմենտներ HepG2 բջիջներում | Ծերացած բջիջների հեռացման փորձարկում չկա։ Կենդանիների կամ մարդկանց երկարակեցության գնահատման ցուցանիշ չկա։ Այստեղ ռեպլիկատիվ կյանքի տևողությունը նշանակում է կրկնապատկումներ լաբորատոր ամանում։ |
| Atamna և համահեղինակներ, Redox Biology 2015, նկարագրված է AMPK-ի և IV համալիրի կենսագոյացման վերաբերյալ հետագա մեխանիստական ուսումնասիրությունում | IMR90 ֆիբրոբլաստներ, հիմնականում 100 nM մեթիլեն կապույտ, AICAR-ը՝ որպես երկարատև AMPK ակտիվացնող համեմատիչ | NAD-ի և NADH-ի հարաբերակցության ժամանակային ընթացք, AMPK-ի անցողիկ ֆոսֆորիլացում, PGC-1alpha-ի և SURF1-ի ինդուկցիա, IV համալիրի ակտիվության ավելի քան 100 տոկոս աճ, օքսիդանտների 28 տոկոս նվազում, տելոմերների ավելի դանդաղ կարճացում, մոտ 18 լրացուցիչ կրկնապատկում՝ AICAR-ի մոտ 2-ի համեմատ, բջջային ցիկլի վրա ազդեցության բացակայություն | AICAR-ի համեմատությունը տարբերվում է մոտավորապես 1000 անգամ մեծ դեղաչափով և յուրահատկությամբ, ուստի ստուգում է ակտիվացման պատկերը, ոչ թե համարժեք պայմաններում ազդեցության ուժը։ Տելոմերների արդյունքը վերաբերում է շաբաթների ընթացքում բաժանվող կուլտուրաներին։ |
| Xiong և համահեղինակներ, Aging Cell 2016, ներկայացված է պրոգերիայի ֆիբրոբլաստներում միտոքոնդրիալ և կորիզային խանգարումների շտկման ուսումնասիրությունում | Հաթչինսոն–Գիլֆորդի պրոգերիայով մաշկի առաջնային ֆիբրոբլաստներ և համապատասխան նորմալ վերահսկիչ բջիջներ, հիմնականում 100 nM՝ 5-ից 12 շաբաթ | Միտոքոնդրիումների ձևը՝ ֆլուորեսցենտային և էլեկտրոնային մանրադիտակմամբ, շարժունակությունը՝ կենդանի բջիջների պատկերմամբ, սուպերօքսիդ, թաղանթային պոտենցիալ, ATP, PGC-1alpha, բազմացման և ծերացման մարկերներ, ինչպես նաև կորիզի բշտիկանման արտափքումներ, պրոգերինի տեղակայում, հետերոքրոմատին և գեների արտահայտում | Հիվանդությանը հատուկ վաղաժամ ծերացման մոդել է, ոչ թե բնականոն ծերացում։ Մորֆոլոգիայի և մարկերների վերականգնումը ծերացած բջիջների հեռացում չէ։ Կենդանիներում արդյունավետության կամ կլինիկական գնահատման ցուցանիշ չկա։ |
| Xue և համահեղինակներ, Cells 2021 ակնարկ, ամփոփված է մեթիլեն կապույտը որպես հակածերացման հավանական միացություն դիտարկող ակնարկում | Ուղեղի ծերացման, նեյրոդեգեներացիայի, մաշկի, վերքերի ապաքինման և պրոգերիայի վերաբերյալ գրականության համադրում | Մեթիլեն կապույտը ներկայացնում է որպես օքսիդավերականգնման ցիկլերում կատալիտիկ դեր ունեցող միացություն, որը կարող է շրջանցել I և III համալիրներով էլեկտրոնների հոսքի որոշ հատվածներ՝ ծերացման ազատ ռադիկալների տեսությունների համատեքստում | Միայն նկարագրական համադրում է։ Համակարգում է վարկածները և նշում, թե որտեղ կլինիկական ապացույցները մնում են ոչ վերջնական։ |
Տողերի ընդհանուր օրինաչափությունն ավելի կարևոր է, քան որևէ առանձին տողը։ Մեթիլեն կապույտի ցածր դեղաչափը բազմիցս կապվում է բազմացման ավելի երկար ժամանակահատվածի, IV համալիրի ավելի բարձր ակտիվության, օքսիդանտների ավելի ցածր ազդանշանների և բարելավված մորֆոլոգիայի հետ։ Փորձարարական սխեման մնում է երկայնական՝ սկսել բաժանվող բջիջներից, մշակել բազմացման ընթացքում և գրանցել, թե որքան երկար է շարունակվում բաժանումը։ Այս կառուցվածքը կարող է հիմնավորել հետաձգման մասին պնդումը։ Այն չի կարող հիմնավորել հեռացման մասին պնդումը՝ առանց այլ փորձարարական սխեմայի։
Ծերացումը հետաձգելը ծերացած բջիջները հեռացնելը չէ
Հետաձգումը նշանակում է, որ բաժանվող բջիջներն ավելի երկար են շարունակում բաժանվել մինչև կանգը։ Հեռացումը, որը հաճախ կոչվում է սենոլիտիկ ազդեցություն, նշանակում է, որ արդեն ծերացած բջիջներն ընտրողաբար ոչնչացվում են կամ դրանց քանակը նվազում է, մինչդեռ բազմացող հարևան բջիջները գոյատևում են։
Մեթիլեն կապույտի վերաբերյալ ֆիբրոբլաստների գրականությունը ստուգում է առաջին կառուցվածքը։ Կուլտուրաները սկզբում բազմացող են, հաջորդական վերացանումների ընթացքում մշակվում են և ավելի ուշ են հասնում բաժանման կանգի։ Հետևաբար, SA-beta-gal-ի, p16-ի, p21-ի և SASP գործոնների նման մարկերները տվյալ վերացանման փուլում հայտնվում են ավելի ուշ կամ ավելի ցածր մակարդակներով։ Այս պատկերը սպասելի է, երբ ծերացման սկիզբը հետաձգվում է։ Այն չի ապացուցում, որ արդեն հաստատված ծերացման վիճակում գտնվող որևէ բջիջ հեռացվել է։
Սենոլիտիկ ազդեցության մասին պնդման համար անհրաժեշտ կլիներ այլ սխեմա՝ նախ կուլտուրան հասցնել հաստատված ծերացման վիճակի, ապա կիրառել միացությունը, հետո ցույց տալ այդ ծերացած բջիջների ընտրողական կորուստը՝ բազմացող վերահսկիչ բջիջների համեմատ, կենսունակության և մահվան ուղղակի չափումներով։ Միայն մարկերի նվազումը բավարար չէ, քանի որ արտահայտումը կարող է փոխվել առանց բջիջների կորստի, իսկ մնացած բազմացող բջիջները կարող են գերաճել ամանում։ Մեջբերված չորս աղբյուրներից ոչ մեկը մեթիլեն կապույտի համար չի կիրառում այդ ընտրողական նվազեցման սխեման, ուստի ճշգրիտ բնորոշումը մնում է in vitro պայմաններում ծերացումը հետաձգող կամ հակածերացման ակտիվություն, ոչ թե սենոլիտիկ ազդեցություն։ Այս տարբերակման օքսիդատիվ սթրեսի կողմը լրացուցիչ բացատրվում է բջիջների կողմից թթվածնի ռեակտիվ ձևերի վերահսկման մասին նյութում։
Անցողիկ ազդանշանավորման արդյունքն ավելի հստակ է ընդգծում այս միտքը։ 2015 թվականի IMR90 ուսումնասիրությունում մեթիլեն կապույտը առաջացրել է NAD-ի և NADH-ի հարաբերակցության կարճատև աճ և AMPK-ի կարճատև ֆոսֆորիլացում, ապա՝ PGC-1alpha-ի և SURF1-ի ինդուկցիա, որոնք երկուսն էլ կապված են IV համալիրի կենսագոյացման հետ։ AICAR-ով AMPK-ի երկարատև ակտիվացումը լրացուցիչ կրկնապատկումների առումով տվել է շատ ավելի թույլ արդյունք։
Ռեպլիկատիվ կյանքի տևողությունը մարդու երկարակեցությունը չէ
Բջջի ռեպլիկատիվ կյանքի տևողությունը հաշվում է մինչև բաժանման կանգը տեղի ունեցած կրկնապատկումները վերահսկվող լաբորատոր ամանում՝ թթվածնի հաստատուն մակարդակով, սննդամիջավայրով և վերացանման ռիթմով։ Մարդու երկարակեցությունը ներառում է զարգացման, իմունային համակարգի, անոթային համակարգի, ցողունային բջիջների միկրոմիջավայրերի, վարքագծի և հիվանդությունների տասնամյակներ։ Միացությունը կարող է երկարացնել առաջինը՝ առանց երկրորդը փոխելու, և մեծամասնության դեպքում հենց այդպես էլ լինում է։
Պրոգերիայի ֆիբրոբլաստներն ունեն որոշակի LMNA մուտացիա, որն առաջացնում է պրոգերին, և բնորոշվում են հատվածավորված ու պակաս շարժուն միտոքոնդրիումներով, ցածր ATP-ով, անկանոն ձև ունեցող կորիզներով և հետերոքրոմատինի կորստով։ Նանոմոլային մեթիլեն կապույտը բարելավել է միտոքոնդրիալ ցուցանիշները և զգալիորեն վերականգնել կորիզային ցուցանիշները՝ ներառյալ պրոգերինի անջատումը թաղանթից։ Սա բջջային մակարդակում տպավորիչ վերականգնում է։ Այն, այնուամենայնիվ, ֆիբրոբլաստների արդյունք է, իսկ հեղինակները կենդանիների վրա փորձարկումները ներկայացրել են որպես ապագա աշխատանք։ Հիվանդության մոդելն ավելի մանրամասն քննարկվում է պրոգերիայի և վաղաժամ ծերացման մոդելներում մեթիլեն կապույտի մասին նյութում։
Սրանից բխում է ընթերցման գործնական ստուգացանկը։
- Հարցրեք՝ մշակումը սկսվել է բաժանման կանգից առաջ, թե արդեն հաստատված կանգից հետո։ Մինչև կանգը սկսելը հիմնավորում է հետաձգումը։ Հեռացումը հիմնավորելու համար անհրաժեշտ են կանգից հետո կիրառման և ընտրողական մահվան տվյալներ։
- Հարցրեք՝ ինչ ընթացք է ունեցել վերահսկիչ խմբի կրկնապատկման կորը։ Առանց կուտակային կրկնապատկումների՝ մարկերների փոփոխությունները մնում են առանց հենակետի։
- Պահանջեք առնվազն երկու դասի մարկեր, օրինակ՝ բազմացման նշիչ՝ p16-ի կամ p21-ի և SA-beta-gal-ի հետ միասին, այլ ոչ թե միայն մեկ ներկում։
- Հարցրեք՝ ինչպես են ներկայացվել տելոմերները։ Ժամանակի ընթացքում յուրաքանչյուր կրկնապատկման հաշվով արագությունը իմաստալից է։ Երկարության մեկանգամյա չափումը՝ ոչ։
- Հարցրեք՝ ինչն է պահվել հաստատուն։ Վերացանման խտությունը, թթվածինը, սննդամիջավայրի փոփոխությունները և մեթիլեն կապույտի թարմ կամ երկար պահված պահեստային լուծույթները բոլորն էլ փոխում են ֆիբրոբլաստների բաժանման կանգը։
Այսպես կարդալու դեպքում ֆիբրոբլաստների գրականությունը մեթիլեն կապույտին տալիս է հետևողական, բայց սահմանափակ դեր․ ցածր դեղաչափով օքսիդավերականգնման ակտիվ միացություն, որը հետաձգում է կուլտիվացվող մարդու ֆիբրոբլաստների ռեպլիկատիվ ծերացումը՝ միաժամանակ բարելավելով միտոքոնդրիալ ցուցանիշները։ Մեխանիզմի առավել մանրամասն տվյալները վերաբերում են անցողիկ էներգետիկ ազդանշանավորմանը և IV համալիրի կենսագոյացմանը, իսկ այս հոդվածներում չկա ծերացած բջիջների հեռացման կամ մարդու կյանքի տևողության երկարացման ապացույց։